Nat:内质网蛋白调控细胞器分布分子 CpK 器moad蛋微管双移

顾汉现

Nature | 内质网蛋白调控细胞器分布的分子机制

细胞器通过motor和adaptor蛋白沿着微管双向移动，进而建立和维持其适当的分布和功能。  器moad蛋微管双移   CLIP63，p180和KTN1优先结合微管的不同子集以维持核周ER的特征性分布

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2022/01/19
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论文
论文标题：ER proteins decipher the tubulin code to regulate organelle distribution
作者：Zheng, Pengli, Obara, Christopher J., Szczesna, Ewa, Nixon-Abell, Jonathon, Mahalingan, Kishore K., Roll-Mecak, Antonina, Lippincott-Schwartz, Jennifer, Blackstone, Craig

期刊：Nature
发表时间：2021/12/15
数字识别码：10.1038/s41586-021-04204-9
摘要：
Organelles move along differentially modified microtubules to establish and maintain their proper distributions and functions1,2. However, how cells interpret these post-translational microtubule modification codes to selectively regulate organelle positioning remains largely unknown. The endoplasmic reticulum (ER) is an interconnected network of diverse morphologies that extends promiscuously throughout the cytoplasm3, forming abundant contacts with other organelles4. Dysregulation of endoplasmic reticulum morphology is tightly linked to neurologic disorders and cancer5,6. Here we demonstrate that three membrane-bound endoplasmic reticulum proteins preferentially interact with different microtubule populations, with CLIMP63 binding centrosome microtubules, kinectin (KTN1) binding perinuclear polyglutamylated microtubules, and p180 binding glutamylated microtubules. Knockout of these proteins or manipulation of microtubule populations and glutamylation status results in marked changes in endoplasmic reticulum positioning, leading to similar redistributions of other organelles. During nutrient starvation, cells modulate CLIMP63 protein levels and p180–microtubule binding to bidirectionally move endoplasmic reticulum and lysosomes for proper autophagic responses.

收起
所属学科：
生物


撰文 | 言笑


胞内细胞器实时发生快速的结构和分布变化，这些改变受到细胞内部环境的调控，反过来作为调控手段去影响细胞内环境，进而执行复杂的细胞功能。细胞器分布的调节对细胞健康至关重要。细胞器通过motor和adaptor蛋白沿着微管双向移动，进而建立和维持其适当的分布和功能【1】。微管通过可逆的翻译后修饰（包括乙酰化、去酪氨酸化和谷氨酰化）获得调节特异性，这些修饰共同构成了微管蛋白密码（tubulin code）的关键元素【2】。研究表明，tubulin code参与微管cargo选择以及细胞器定向运动【2】，但细胞如何破译这些tubulin code以选择性地调节细胞器定位尚不清楚。

内质网（Endoplasmic reticulum, ER）是一个由不同形态组成的相互连接的网络，在整个细胞质中混杂延伸，与其他细胞器形成丰富的接触。内质网形态失调与神经系统疾病和癌症密切相关。

2021年12月15日，来自美国国立卫生研究院的Craig Blackstone团队在Nature杂志上在线发表了题为ER proteins decipher the tubulin code to regulate organelle distribution的研究论文，阐释了内质网蛋白调控细胞器分布的具体机制。研究人员证明了三种膜结合的内质网蛋白优先与不同的微管群体相互作用：CLIMP63结合中心体微管，KTN1结合核周多聚谷氨酰化微管，p180结合单谷氨酰化微管。这些内质网蛋白质的敲除或微管群的操纵和谷氨酰化状态改变均会导致内质网定位的显著变化，进而引起其他细胞器在胞内的重新分布。


大多数关于ER shaping和细胞器接触的研究都集中在外周管状ER，而更致密的核周ER是如何形成和不对称分布的目前还不清楚。三种ER膜结合蛋白— CLIMP63，p180和KTN1—主要定位于核周ER，被认为是内质网片状形成（sheet-forming）蛋白【3】。作者首先探究了这三个蛋白在调控内质网形态和分布中的功能。如图1所示，在CLIMP63和KTN1单敲除细胞的外周ER中的致密基质或片状结构数量增加，该现象定义为“分散（dispersed）”表型；而p180敲除细胞中的ER则表现出一种相反的“聚集（clustered）”表型——其外周网络保持管状，但核周 ER 在核的一侧不对称地塌陷成较小的区域；CLIMP63-KTN1双敲导致更明显的“dispersed”ER，而CLIMP63-p180双敲细胞中的ER与野生型中的类似；值得注意的是，p180-KTN1双敲造成比p180单敲更多的ER聚集；在CLIMP63-p180-KTN1三敲的细胞中，高密度的ER基质或片状结构在核周区域富集。

为了更好地定量评估ER形态和分布的变化，作者开创了互补算法（complementary algorithms），利用基于概率密度估计的统计方法来分析荧光标记的ER和其他细胞器的空间分布，使用实验得出的空间概率质量函数来量化图像上的荧光变化，以计算细胞器的径向分布和细胞不对称程度。数据显示，CLIMP63 和 KTN1 单敲除或双敲除增加了 ER 平均分布半径 （Mean distribution radius, MDR），说明ER 的外周分布更广；相反，p180敲除或p180-KTN1双敲增加了ER不对称性。其中微管MDR和不对称性仅略有变化。


图1. CLIMP63、p180 和 KTN1 差异性调节 ER 形态及分布

随后，作者通过co-sedimentation实验评估了多种ER蛋白与微管的结合能力。与预期的结果一致，CLIMP63、p180和KTN1均可以结合大量微管。作者发现，只有能够进行微管结合的野生型蛋白质或突变体才能恢复相应敲除细胞系中的ER形态。例如，CLIMP63错义突变体R7A，K10A和R70A不能结合微管或抑制CLIMP63敲除细胞中的ER分布缺陷，而结合微管的CLIMP63（H69A）可以拯救表型；对于KTN1，只有结合微管的缺失突变体可以抑制异常的ER表型；缺乏kinesin-1结合结构域的p180s仍然可以抑制p180-敲除细胞中的ER聚集表型。这些数据表明CLIMP63-、p180-和KTN1-敲除细胞中ER形态的改变可能都与微管结合改变相关。因此，作者推测这些蛋白质可以结合不同的微管群体，并采用邻近连接测定（proximity ligation assay, PLA）来可视化它们在细胞中的微管结合情况。作者使用centrinone B耗尽中心体微管，并通过敲除AKAP450去除高尔基源性微管。结果显示CLIMP63-microtubule association对中心体耗竭敏感，但高尔基体微管耗竭不敏感；KTN1-microtubule association对两者都敏感；p180-microtubule association对中心体或高尔基微管的消耗都不敏感。进一步分析证明，CLIMP63优先结合中心体微管，KTN1优先结合来自中心体或高尔基体的核周微管，p180优先结合更多的外周微管。

为了获得调节特异性，微管经历可逆的翻译后修饰，包括乙酰化、去酪氨酸化和谷氨酰化【2】。虽然 CLIMP63、p180 或 KTN1 敲除不影响这些修饰的总体水平，但微管蛋白多聚谷氨酰化在中心体或高尔基体微管耗尽的细胞中降低。因此，作者纯化了含有微管结合域的p180、KTN1和CLIMP63片段，并在体外探究它们与谷氨酰化微管的结合。与KTN1相比，p180与单谷氨酰化微管表现出更高的体外结合，而p180和KTN1与多聚谷氨酰化微管结合能力相似。同时，KTN1更倾向于结合具有多聚谷氨酸链的微管，而不是具有多位点单谷氨酸链的微管。与p180和KTN1相反，CLIMP63对微管谷氨酰化的反应较差，不同的微管蛋白修饰或相互作用可能介导了CLIMP63与中心体微管的优先结合。总的来说，如图2所示，CLIMP63，p180和KTN1分别优先结合中心体、多聚谷氨酰化和谷氨酰化微管，进而协同调节ER分布。


图2. CLIMP63结合中心体微管，KTN1结合多聚谷氨酰化微管，p180结合谷氨酰化微管。

接下来，作者对其他细胞器的分布进行了分析。通过同时对六个细胞器的活体成像显示，大多数细胞器的分布与ER相似，提示 ER 可能广泛调节细胞器分布。值得注意的是，在CLIP63-，p180-和KTN1-敲除细胞中，所有细胞器都表现出与ER相似的分布变化：在CLIMP63-或KTN1-敲除细胞中更分散，在p180-敲除细胞中更不对称。此外，分散ER的CCP1过表达也增加了野生型细胞中溶酶体，线粒体和过氧化物酶体的MDR。

最后，作者探究了在自噬过程中ER和溶酶体的迁移活动。核周溶酶体聚集是早期自噬的标志性事件，对于适当的自噬通量很重要【4-5】。与溶酶体类似，ER 在早期自噬期间迁移至核周，随后重新分布到外周。CLIMP63蛋白水平在早期自噬期间显着增加，CLIMP63敲除可以阻止ER向核周区域移动，并抑制自噬体-溶酶体融合和自噬降解，但并不影响溶酶体活性。p180和KTN1蛋白水平在早期自噬期间保持不变，KTN1-microtubule association不变，但p180-microtubule association增加，进而重新分布ER和溶酶体。p180-敲除细胞中的ER和溶酶体始终留在核周。作者还阐释了p180与微管结合的生理学意义，如图3所示，p180L的核糖体结合区（主要的异构体）包含41个带正电荷的十肽重复，该区域在正常细胞条件下（Normal）被核糖体占据，但在饥饿条件下（Starved），与核糖体发生解离，暴露出这些带正电的区域，随后结合微管。


图3. (e) p180结构域组成；(f) p180在正常和饥饿条件下与微管结合。

总的来说，该研究证明了CLIP63，p180和KTN1优先结合微管的不同子集以维持核周ER的特征性分布，从而解释了它们缺失的差异效应。微管在细胞器分布中起着关键作用，它们选择性分配细胞器的能力依赖于“tubulin code”。该研究表明：（1）ER分布是通过特定的膜结合蛋白介导的，与不同水平和类型的微管谷氨酰化有差异结合，广泛影响大多数其他细胞器的分布；（2）细胞不是通过赋予每个细胞器自己的感知和响应机制，而是通过将ER作为一线传感器和响应器来实现组织效率。作者认为可能还有其他ER蛋白也可以破译tubulin code，对ER在健康和疾病中的功能具有重要意义。
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制版人：十一

参考文献

1. Barlan, K. & Gelfand, V. I. Microtubule-based transport and the distribution, tethering, and organization of organelles. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 9, a025817 (2017).
2. Roll-Mecak, A. The tubulin code in microtubule dynamics and information encoding. Dev. Cell 54, 7–20 (2020).
3. Shibata, Y. et al. Mechanisms determining the morphology of the peripheral ER. Cell 143, 774–788 (2010).
4. Korolchuk, V. I. et al. Lysosomal positioning coordinates cellular nutrient responses. Nat. Cell Biol. 13, 453–460 (2011).
5. Jia, R. & Bonifacino, J. S. Lysosome positioning influences mTORC2 and AKT signaling. Mol. Cell 75, 26–38 (2019).

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文章标签
细胞器
微管蛋白密码
内质网
内质网蛋白
细胞器分布
CLIMP63
KTN1
p180

https://www.nature.com/articles/s41586-021-04204-9

https://www.linkresearcher.com/t ... a-9930-c7ea63880cd9



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