李殷：质粒与基因工程

顾汉现

李殷：质粒与基因工程

上传: 360201000005210030     更新时间：2013-6-20 22:22:38

                     李殷：质粒与基因工程  

华东师范大学生命科学学院

摘要   质粒是细小、环状、独立于染色体外，能自主复制的DNA，含有少量基因。原核细胞质粒含有可控制原核细胞发育，转移对药物的耐药性、毒性产物，降解碳源等基因。近代可利用质粒研究各种机体基因结构与功能的关系，作为研究基因工程的工具与技术。
一、质粒
质粒(plasmid)是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于微生物细胞中，细菌中含量最丰富，在螺旋体、放线菌、酵母菌中也有发现。它能在完整细菌间进行传递，也能在细菌分裂时伴随染色体分配到子代细菌，但它并不是细菌生长繁殖所必须的遗传物质。质粒控制着多种不同的遗传性状，尤其与细菌的抗药性、致病性有关。
(一)质粒的分子结构
电镜下的质粒一般是共价、闭合、环状、小型双链超螺旋的DNA分子(cccDNA)，但也有少量的线性DNA质粒和RNA质粒。
(二)质粒的类型
1  按质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应分
1)致育因子(fertility factor，F因子)
又称F因子或性因子。带因子的菌株称F+菌株相当于雄性，无F因子的菌株称为F-菌株相当于雌性。F因子可以以游离状态存在于细胞中，也可以与染色体结合。F质粒整合到染色体上的菌株称之为高频重组菌株(high frequence recombonation，Hfr)。
2)抗性因子(resistance factor，R因子)
包括抗药性与抗重金属性两大类。
3)Col质粒亦称因子。在大肠杆菌中，编码产生细菌蛋白大肠杆菌素。大肠杆菌素只杀死近缘且不含Col质粒的菌株，但不影响宿主。
4)毒性质粒(virulence plasmid)
许多致病菌的毒性由此引起。如炭疽杆菌。炭疽杆菌引起宿主感染死亡主要依靠其毒素和荚膜的毒力基因。炭疽的毒力因子是编码毒力基因的pOX1和pOX2两个毒力质粒。质粒pOX1有184.5Kbp，其功能是编码产毒基因，产生毒力因子和各种毒素。荚膜毒力基因复合体则是由三种毒素成分即保护性抗原，致死因子和水肿因子所组成。这三种毒素成分在致病时结合成水肿毒素和致死毒素两种复合毒素。水肿毒素由水肿因子和保护性抗原组成，致死毒素则由致死因子和保护性抗原组成。致死毒素刺激宿主巨噬细胞释放大量肿瘤坏死因子，可促发全身性炭疽病人的突然死亡。质粒pOX2含95.3Kbp，编码capB、capC和capA3个基因。这些基因都是pOX1中荚膜蛋白合成所必须的。已确定pOX1与pOX2两个毒力质粒在炭疽杆菌致病过程中彼此依存，联合编码产生毒素。任何一个质粒缺失都将产生减毒株。又如苏云金芽抱杆菌的伴抱晶体中的内毒素的基因也位于质粒上。
5)代谢质粒(metabolic plasmid)
又名降解质粒。其上含降解某些基质的酶的基因，可以将复杂的有机物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式。如假单胞菌。
6)隐蔽性质粒(crypticc plasmid)
它们不产生任何表型效应。
2   按质粒的拷贝数分
1)松弛型质粒(relaxed plasmid)，又名高拷贝数质粒(hign copy number)
每个宿主细胞中有10一100个拷贝，在一定条件下可大量扩增至上千个拷贝。质粒有多个复制周期，独立于细菌细胞而自主复制。多为小质粒。
2)严紧型质粒(stringent plasmid)，又名低拷贝数质粒(low copy number)
每个宿主细胞中有1一4个拷贝，随细菌染色体的复制同步进行。多为大质粒。
3  按宿主范围分
1)窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)
有特异的复制起点，只能在特异的宿主细胞中复制。
2)广宿主范围质粒(broad host range plasmid)
质粒DNA不但能在细菌中复制，而且在增加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核或真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达。因此，这类质粒载体在基因工程中应用广泛。
(三)质粒的功能
一般携带编码某些功能的基因，对细胞是有用的，但不是必须的，即与正常的生长和细胞分裂无关。功能包括致育(F因子)、抗性(R因子)、降解、产毒素、防御等等。
(四)质粒的性质
1   自主复制
2   不相容性(incompatible)
相类似的质粒在同一个细胞中不能共存。原因不能完全了解，但可能是如果质粒基因有相同的复制起始点ori与rep，在复制时仅有一种质粒被启动，而另一被抑制。这种复制的选择性在数代积累后，就会产生质粒的不相容性。
3   可传递性
具有tra基因的质粒可以在多个细胞间传递，这也是基因工程的基础。
4   产生宿主的某些生物学特性，如抗性等。
(五)质粒的复制
1   利用宿主的复制系统，这多见于非常小的质粒，而且需要复制原点
2   携带特殊的基因，为其复制转录产生必需的成分，多见于大的质粒
3   整合到宿主细胞染色体上，随其复制而复制，称为附加体(episomes)
(六)F质粒与接合
1   接合(conjugation)指通过质粒使遗传物质在两个细胞间的转移的机制。接合的前提是两个细胞的直接接触。一个含有结合质粒(F+，致育性)的细胞与不含结合质粒(F一)的细胞借助于细胞表面的F一性菌毛形成交配个体。性菌毛收缩，拉两个细胞接触，从含有质粒的细胞(供体)DNA转移到受体。在F质粒上携带的tra基因，含有结合过程所有的信息。
2   整合与Hfr菌株:许多F质粒可以插人序列，同源序列间重组，导致F质粒整合在染色体的基因组特定位点上。这样含有整合的质粒的菌株称为Hfr菌株。
3   F’因子：F因子从染色体上切离通常是精确的，但偶然F质粒会选出一段染色体基因形成F’基因。
(七)酵母菌的质粒
称之为2μm的质粒。特点如下：
1）封闭环状的双链DNA分子，高拷贝数；
2）各含600bp长的一对反向重复顺序；
3）有两种异构体
4）属隐蔽型质粒。
二、质粒和基因工程
基因工程（gene engineering）是指按人们科研或生产的需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质(DNA片段)，在体外切割、拼接形成重组DNA，然后将重组与载体的遗传物质重新组合，再将其引人到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定的遗传给下一代。
基因工程的基本内容如下：
1）从生物有机体的基因组中分离出带目的基因的DNA片段；
2）将带目的基因的外源DNA片段连接到能自我复制的载体分子上，形成重组的DNA分子；
3）将重组的DNA分子转移到适当的受体分子内；
4）筛选获得重组的DNA分子的受体细胞克隆（clone）；
5)克隆基因的表达，产生出人类所需要的物质。
但目的基因在经过体外改造后，必须进人受体细胞内才能进行扩增和生物表达。但是用于DNA重组体的目的基因，不能直接引入受体细胞。因为每种生物都是长期进化的产物，具有很强的排他性。外源DNA如果单独进人受体细胞，必将被破坏。因此，必须有一种运载基因的载体作媒介物，才能达到目的。所谓载体，是指具有自我复制能力的DNA分子，其上可以连接分离后的不能自我复制的目的基因的DNA片段。载体在基因工程中的作用，就像过河时必须有船一样。载体运载外源DNA进入受体细胞，是通过在载体自身的DNA核酸序列中插入外源DNA，再进人受体细胞内进行复制，在载体DNA复制时，外源DNA分子也获得了扩增和表达。
目前经常使用的载体，有质粒、入噬菌体、勃粒(co耐d)和病毒四类。
根据克隆外源DNA的方式，可将载体分为插人型(insertion)和置换型(substitution)两类。绝大多数载体是插人型，即在载体的克隆位点上用限制性内切核酸酶酶切后，将外源DNA插人，再用连接酶连接。重组后的载体分子是原先的大小，再加插人片段的大小。少数载体分子如入噬菌体基因组的中间片段与噬菌体的感染能力和DNA的复制功能无关，因此这个片段可以用限制酶加以切除，代之以外源DNA片段。这个片段的大小与被置换的片段大小相仿，所以重组后的载体分子的大小改变不大。
根据载体的用途，可将载体分为克隆载体和表达载体。前者是克隆了外源DNA后，转人宿主细胞进行增殖，使克隆的DNA片段在数量上大大扩增。后者是将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达产生蛋白质。
各种不同的载体，尽管分子量大小、结构和用途上存在着较大的差异，但是作为载体，它们应该具备一些共同的特性:
l)能在受体细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在其DNA插人外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性;
2)易于从宿主细胞中分离，并进行纯化;
3)在其DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点。这些位点位于DNA复制的非必需区可在这些位点上插人外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制;
4)有选择标记基因或报道基因，即具有能够观察的表型特征，在插人外源DNA后，这些表型特征可以作为重组DNA的选择标志;
5)插人型载体上的限制性内切核酸酶的酶切位点对一种限制酶只有一个;而置换型载体上被置换片段的两端可以各有一种限制酶的一个酶切点；
6)克隆载体上要有复制起点，表达载体还需有启动子
质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子，是在细菌细胞分裂时能稳定传递给子代的遗传因子。由于细菌是一种简单的生物，对自身活动调控的机制并非绝对完美无缺，于是它为人们巧妙施用基因偷换术提供了可能。因此，我们可以借助于质粒，将基因或基因群带人细菌细胞并使其遗传信息得以表达，改变或修饰寄主细菌原有的代谢产物或产生新的物质。大肠杆菌和它的质粒DNA是DNA重组技术中最理想的载体系统，常常用来做建立基因的基因库或当作有用物质的生产车间。事实上，1973年，美国斯坦福大学教授科恩从大肠杆菌里取出两种不同的质粒，它们各自具有一个抗菌素药基因，他把这两个基因“裁剪”下来，再将其“拼接”在同一个质粒中，形成杂合质粒。当这种杂合质粒进人大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌就能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表示杂合质粒在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。它标志着基因工程的首次胜利。1974年，科恩又把金黄色葡萄球菌的质粒(上面具有抗青霉素的基因)和大肠杆菌的质粒“组装”成杂合质粒，送入大肠杆菌体内，使这种大肠杆菌获得了对青霉素的抗药性。这说明，金黄色葡萄球菌质粒上的抗青霉素基因，由杂合质粒带到大杆菌体内，更重要的是表明外来基因在大肠杆菌体内同样也可以表达。科恩又将非洲爪蟾的DNA与大肠杆菌的质粒“拼接”，获得成功，拼接后的杂合质粒进人大肠杆菌，产生了非洲爪蟾的核糖体核糖核酸(西幽A)。两栖动物的基因能在细菌里发挥作用，也能在细菌里不断复制的事实说明，基因工程完全可以不受生物种类的限制，而按照人类的意愿去拼接基因，创造新的生物。
除了质粒之外，细菌病毒，也就是噬菌体病毒等也可以作为载体。但是，质粒和病毒在作为基因工程载体时是有所区别的。利用病毒作为基因运载体时，所带的基因一般还需要转到受体细胞的染色体DNA中去，才能成为稳定的结构。质粒的情况也可以是这样，但大多数情况下不是如此。质粒一旦带有人所需要的新基因，它本身就可能成为一种稳定的重组DNA。进人受体细胞后，它多半不需要把所带的基因转到受体细胞的染色体上去，这样的质粒就会进行自我复制，异源性DNA也得到了复制。这就是利用质粒作为基因运载体表现优越的地方。此外，质粒易于从培养细菌中纯化，而且经常包含编码特殊蛋白质的基因，这种蛋白质可使细菌获得对抗生素，如氨节青霉素(ampicillin)、四环素(tetracycline)的抗性，所以通过在含有抗生素的平板上培养，即可筛选出质粒转化的细菌，因为只有具有抗生素抗性的细菌才能生长。所以目前进行的基因工程操作，多用质粒作为基因的运载体。
作为载体的理想质粒的条件是:
1)能自主复制，有独立的复制起点;
2)具有一种或多种限制酶的单一切割位点，若在此位点中插入外源的基因片段，不影响本身的复制功能;
3)在基因组中有1一2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征;
4)相对分子量小，拷贝多，易操作;
5)易导人细胞;
6)具有安全性，重组质粒不易扩散至实验室外
我们可以用作载体的质粒分为天然与人工两种，天然的质粒如c毗1及其派生质粒pmBI、psC101、PcRI;人工改良的如pBR322。其中最早发展应用的质粒之一是pBR32。这种质粒具有两个基因，可使宿主菌获得对氨节青霉素和四环素两种抗生素的抗性。在克隆过程中，外源DNA插人四环素基因，使其失活，这样就可通过细菌对氨节青霉素具抗性，而对四环素不具抗性来筛选重组质粒转化的细菌。有些质粒没有与外源DNA连接，只是自身再连接，具有这种质粒的细菌可通过具有两种抗生素抗性而被筛选出来。随pBR32质粒后出现的puC系列质粒，可通过称为蓝白选择(blue/whiteseleetion)的方法筛选具有质粒的克隆。这种方法基于质粒载体具有一个编码β一半乳糖苷酶的称为lacz的基因，外源DNA即插人这个基因。如细菌携带完整的质粒，即合成β半乳糖苷酶，此酶可以催化人工合成的底物X一gal(5一溴一4一氯一3一吲哚一β一D半乳糖苷)产生有色产物，所以当细菌在含有x-gal的琼脂平板上生长时，产生蓝色菌落，但当外源DNA片段插人pUC质粒后，导致lacZ基因失活，从而不再产生β半乳糖苷酶，结果具有重组质粒的细菌在含有x一gal的琼脂平板上生长时，产生白色菌落，极易与产生蓝色菌落的克隆(内含自连质粒)相区分。
PUC载体的另一有用特性是lacZ基因的一部分序列经修饰后，形成称为多克隆位点(multi-pledoningsite，MCS)的限制酶位点簇，其目的在于增加克隆过程中的灵活性，使外源DNA可于其中任何一个酶切位点插人。
质粒的另一些改进包括:在多克隆位点的任一端加上来自噬菌体的启动子序列，这样在RNA聚合酶的作用下，使插人的外源DNA可进行体外转录。这一性质可用于从克隆的序列产生RNA探针。还有一些改进的质粒可使克隆的序列翻译成蛋白质，这样的质粒称为表达载体(expresionvector)。
三、质粒在转基因中的应用一Ti质粒
Ti质粒(Ti plasmid)产生于根瘤菌(Agrobacte-rium tumefaciens)中，其中可以以T一DNA整合到植物染色体的DNA中。因而用T一DNA作为克隆载体，利用T一DNA的整合能力，携带有用基因进入植物基因组中，产生优良隆状，如抗病虫害、抗逆(抗盐、碱等)、耐除草剂、延长水果蔬菜的贮存期、产生药物、抗体、疫苗等。
其中，最引人注目的是转基因食品及其安全性的问题。转基因食品，就是利用基因工程手段，人为的将某些生物的基因转移到其他生物中去，通过改造生物的遗传物质，使其在营养品质、消费品质等方面向人类所需要的目标转变，以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品就是转基因食品。从理论上讲，通过这种手段，人们可以按照自己的意愿得到所需要的食品。例如，将抗病虫害、抗除草剂等基因转人农作物，就可以获得具有相应基因的品种。还可以缩短获得新品种的时间，提高农作物的产量、增加作物的营养价值，生产一些高附加值的物质，如有药用价值的物质、维生素、工业上用的生物高分子聚合物等。世界上第一例转基因植物诞生于1983年。目前还没有证据表明转基因食品会对人体健康造成危害。但是，在基因操作过程中，可能发生意想不到的变化。对于健康和环境的长期影响，科学研究还不深人。因此，很多国际组织、国家和地区，如欧盟、英国、澳大利亚、新西兰、香港等，都制定了相应的法律、法规，对转基因产品进行管理和标注，以便进行监控。
综上所述，质粒虽然是微生物细胞中的极为微小的组分，但是在生物学的发展中有十分重要的作用和远大的前景，因此，对我们生物系的学生而言，对质粒的了解是十分必要的。
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顾汉现

华东师范大学生命科学实验教学中心近五年来本科生发表论文汇总（2007）：

http://www.doc88.com/p-7965482222768.html