耳针对拟阿尔茨海默病模型大鼠海马神经原纤维缠结的影响

顾汉现

耳针对拟阿尔茨海默病模型大鼠海马神经原纤维缠结的影响


[ 10-02-06 10:03:00 ]  作者：苗婷 潘娅 王旭东 蒋乃昌


【摘要】  目的： 研究耳针对拟阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）模型大鼠海马神经原纤维缠结（NFT）的影响。方法： 采用冈田酸(Okadaic Acid，OA)海马CA1区微量多次注射建立拟AD大鼠模型，针刺肾、脑耳穴，观察大鼠行为学变化，Bielschowsky染色观察海马神经原纤维缠结（neurobrillary tangles，NFT)。结果： 与模型组比较，耳针组大鼠平均逃避潜伏期明显缩短（P<0.01），第Ⅲ象限活动时间明显延长（P<0.01），穿越站台次数明显增多（P<0.01），海马CA1区NFT数量明显减少（P<0.01）。结论： 耳针可显著改善拟AD模型大鼠学习记忆能力，抑制NFT的形成。

【关键词】  阿尔茨海默病 神经原纤维缠结 耳针疗法 大鼠 SpragueDawley

阿尔茨海默病是一种发病率高，危害性大的中枢神经系统退变性疾病，在65岁人群中AD的发病率在5％～10％，85岁以上的老年人中发病率约为25％[1]。AD病最早表现为海马病变所致的记忆缺损，接着是大脑皮层病变，最终导致记忆恶化及语言、空间等认知功能的丧失。AD在病理上有三大特征：脑细胞外以淀粉样蛋白(amyloid protein，Aβ)为中心的老年斑(senile plaques，SP)，脑细胞内由高度磷酸化的微管相关蛋白tau蛋白构成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)，胆碱能神经纤维功能退化[2]。目前AD的病因及发病机制尚未完全明了，治疗上也没有特别有效的药物。祖国医学认为肾虚精亏、浊毒痹阻脑络可能是其主要的病理基础，而针灸可以补肾填精、健脑益智。为探索AD非药物疗法的新途径，对AD大鼠模型给予耳针治疗，观察大鼠学习记忆及海马CA1区NFT形态和数量的变化，探讨耳针治疗对拟AD模型大鼠的作用及其机理。

    1  材料与方法

    1.1  动物和分组

    3～5月龄SD雄性大鼠30只，体重220～280 g，由贵阳医学院实验动物中心提供[合格证号：SCXK(黔)2002—0001]。随机分为3组：对照组、拟AD模型组、耳针治疗组，每组10只，自然条件下笼养、喂食。

    1.2  试剂和仪器

    OA购自美国sigma公司；脑立体定位仪DYTI，中国天津生产；Morris水迷宫，上海吉量软件科技有限公司产品；显微镜(带摄像装置及图像分析系统)，德国Leica公司产品。

    1.3  拟AD动物模型的建立

    大鼠称重，10%水合氯醛麻醉(0.3ml/100g)后，固定于大鼠脑立体定位仪上，参照George Paxinos[3]的大鼠脑立体定位图谱，于前囟后3.6 mm，中线右侧旁开2.4 mm处垂直插入自行设计的十字形小管，牙科水泥固定。然后通过纵管进行海马CA1区微量注射(深度2.7 mm)，拟AD模型组、耳针治疗组缓慢注射0.4 mmol/L的OA(用10%的二甲亚砜溶解配制)0.5 μl，5 min注射完毕，留针10 min，隔1 d同样剂量注射1次，共5次；对照组同样方法注入等体积的对照液10℅DMSO。术后创面滴庆大霉素，肌肉注射青霉素预防感染。

    1.4  耳针治疗方法

    　　耳针治疗组于拟AD模型制作同时进行。常规消毒后用无菌针灸针埋入大鼠脑、肾耳穴[4]，每日1次，治疗3周，每日检查耳针是否脱落，若有脱落即补上。

    1.5  观测指标

    1.5.1  水迷宫实验  各组大鼠于海马末次注射完的第3周后进行Morris水迷宫定向航行实验和空间探索实验，共7 d。第1～6天进行定向航行实验，每天将大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限顺序从各入水点面靠池壁放入水中，记录60 s内大鼠从入水池到爬上站台所需时间即为潜伏期。每只大鼠每天训练4次，上下午各2次。第7天空间探索实验，撤去站台，将大鼠从第Ⅰ象限入水点放入水池，记录120 s内大鼠在第Ⅲ象限的游泳时间和穿越站台的次数。

    1.5.2  灌注取材  水迷宫实验结束后，大鼠用10％水合氯醛麻醉，生理盐水和4％中性多聚甲醛灌注后，断头取脑，置4％中性多聚甲醛浸泡固定。取海马注射点前后约3 mm厚标本，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后，大鼠海马冠状位切片，片厚3 μm。

    1.5.3  改进的Bielschowsky染色  切片脱蜡至水化，于37 ℃温箱内用2％硝酸银水溶液避光浸染25～35 min；福尔马林液还原数秒钟至切片呈现黄色为止；用氨银溶液滴染20～40 s，福尔马林液再次还原1～2 min，使切片呈棕黄色；用0.2％氯化金溶液调色2～5 min；5％硫代硫酸钠水溶液固定3～5 min；然后经乙醇脱水，二甲苯透明，中性塑胶封固。

    1.5.4  显微镜观察  采用Leica摄像显微镜观察并照像。NFT可在海马形成并在轴突处染色较深呈拖尾状，计数每张切片4个随机高倍视野中神经元NFT样改变数，并取平均值作为计数结果。

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    1.6  统计学处理

    应用SPSS 11.5统计软件分析，统计结果以x±s表示，数据首先进行单因素方差分析，组间比较用t检验。

   2  结果

    2.1  水迷宫实验

    对照组、拟AD模型组、耳针治疗组的平均逃避潜伏期不断缩短，从第1天开始，拟AD模型组与对照组比较，平均逃避潜伏期明显延长(P<0.01)；耳针治疗组与拟AD模型组比较，平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.01)，见表1。空间探索实验结果表明，拟AD模型组与对照组比较，第Ⅲ象限活动时间明显缩短(P<0.01), 穿越站台次数明显减少(P<0.01)；耳针治疗组与拟AD模型组比较，第Ⅲ象限活动时间明显延长(P<0.01)，穿越站台次数明显增多(P<0.01)。见表1。表1  各实验组大鼠平均逃避潜伏期注：(1)与对照组比较，P<0.01；(2)与拟AD模型组比较，P<0.01。表2  各实验组大鼠第Ⅲ象限活动时间和穿越站台次数注：（1）与对照组比较，P<0.01；（2）与拟AD模型组比较，P<0.01。

    2.2  海马CA1区NFT

    Bielschowsky染色观察发现，对照组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、密集，胞体呈圆球形，神经细胞内神经原纤维排列有序，未见拖尾且染色较深的轴突(图1a)；拟AD模型组大鼠海马CA1区神经元排列散乱，神经细胞内神经原纤维增粗、紊乱，或密集呈团块状、编织状，遍布全部细胞质并深入细胞突起，形成染色较深的拖尾状，即NFT(图1b)；耳针治疗组大鼠海马CA1区未见明显改变，神经元排列较整齐，少见染色较深的拖尾状轴突(图1c)，与拟AD模型组比较，神经元NFT样改变数量显著减少（P＜0.01），见表3。表3  海马CA1区神经元NFT样计数

　　3  讨论

    AD患者最具特征性的神经病理改变之一是神经元内出现大量的NFT，多位于新皮质椎体细胞、海马CA1段及杏仁核，存在于神经元的胞体、神经轴突丝和神经突起中[5]。OA是Tachibana等（1981）从Haliehondria okadai提取出的聚醚类单羧酸化合物(C44H66O13,Mr 802)。研究证明，OA是蛋白磷酸酶PP1和PP2A的抑制剂[6]，能使tau蛋白高度磷酸化并形成NFT样改变[7]。学习记忆功能障碍是AD的显著特征之一，实验中通过Morris水迷宫测试发现，拟AD模型组大鼠平均逃避潜伏期明显延长、第Ⅲ象限游泳时间和穿越站台次数显著减少，表明模型组大鼠学习记忆能力受损。

   中国古代早有针灸治疗老年期痴呆的相关记载，祖国医学认为肾精气亏虚、髓海不足为其根本原因[8]，治疗应以补肾益精为主。《内经》云：“耳为宗脉之所聚”，十二经脉均上于耳，针刺耳穴可调节全身脏腑器官的病症。耳穴脑具有调节大脑皮层兴奋或抑制的作用，耳穴肾可益精血、补脑髓、畅活气血。研究表明，针刺耳肾、脑穴可以改善血管性痴呆大鼠的学习记忆[9]。欧阳颀等[10]采用补肾填精益髓法，以百会(或四神聪)、肾俞为主穴，电针治疗轻中度AD患者30例，结果患者的时空定向力、计算力和认知水平均明显提高。现代临床研究也表明，针灸可明显改善大鼠的学习记忆能力和脑组织形态学异常，可能与增加生长抑素在脑内的含量、减轻自由基损伤、提高脑乙酰胆碱含量、抑制神经细胞的凋亡等有关[11～13]。

   本实验对拟AD模型大鼠施以耳的肾、脑穴位治疗，通过水迷宫实验发现可以显著改善其学习记忆功能(P<0.01)，进一步表明了耳针有改善拟AD大鼠学习记忆的作用。在Bielschowsky染色中发现，耳针治疗组海马神经元内NFT数量减少，与拟AD模型组比较差异显著(P<0.01)。NFT是导致神经元纤维退化的主要原因，目前认为NFT的形成与AD病人的认知功能障碍呈明显的正相关[2]。NFT的主要成分是过度磷酸化的Tau蛋白和少量微管蛋白，正常tau蛋白可促进微管蛋白聚集成微管并增强其稳定性，从而维持轴突的生长发育和神经元极性的形成[14]。在AD中，Tau蛋白发生明显的病理变化，过度磷酸化形成NFT样改变[15]，从而失去与微管结合的能力，阻断细胞核与轴突之间的蛋白运输通路，使细胞调节、制造蛋白的功能降低，导致神经元功能丧失，产生AD的某些症状[16]。本研究中，耳针治疗组的NFT减少，推测针刺耳肾、脑穴可能通过抑制拟AD模型大鼠tau蛋白的异常磷酸化，导致NFT合成减少，保证了轴浆的正常运输而改善学习记忆功能。

【参考文献】
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　[10]欧阳颀,李忠仁,穆艳云,等.针刺对16例阿耳茨海默病患者智能障碍影响的对照观察[J].安徽中医临床杂志,1999(3)：158-159.

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