睡眠剥夺及睡眠恢复后大鼠视交叉上核星形胶质细胞的反应

顾汉现

睡眠剥夺及睡眠恢复后大鼠视交叉上核星形胶质细胞的反应
及其与神经元的关系

（转帖）

惠雪枫1，2，宿长军1，李柱一1

1第四军医大学唐都医院神经内科，2延安大学医学院

摘要 目的：探索睡眠剥夺（SD）一个生理周期，以及SD一个生理周期后立即进行短时间睡眠恢复，大鼠视交叉上核(SCN)星形胶质细胞（AS）的反应及其与神经元的关系。方法： 采用水环境小平台法建立大鼠睡眠剥夺模型，12只SD雄性大鼠随机分为睡眠剥夺24h（SD）组，睡眠剥夺24h后恢复睡眠3h（SR）组，24h大平台对照（TC）组和正常单独饲养（NC）组，每组3只。用免疫组织化学的方法检测胶原纤维酸性蛋白（GFAP）和Fos神经元在SCN的表达变化。结果：睡眠剥夺后GFAP和Fos在SCN的表达都明显增强，睡眠恢复后二者表达都降低，变化趋势基本一致。结论：视交叉上核的星形胶质细胞可能与神经元共同参与睡眠的调节。

关键词 睡眠剥夺；视交叉上核(SCN)；星形胶质细胞；GFAP；Fos；大鼠

Response of astrocytes to sleep deprivation and sleep recovery and its relationship with neurons at rat，s SCN
HUI Xue-Feng1，2，SU Chang-Jun1，LI Zhu-Yi1，ZHANG Run-ning3
（1Department of Neurology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University， Xi’an 710038，China， 2Medical Department，Yan，an University，Yan，an 716000，China，3Department of Neurology，Second textile hospital of Shaanxi，Xianyang 712000，China）
Abstract: Objective To investigate the response of the astrocytes to sleep deprivation and sleep recovery at rat,s SCN, as well as its relationship with neurons．Methods 12 Sprague-Damley rats were divided into four groups at random．Tow groups were deprived of sleep by housing them on the small platforms over water for 24h and then one group recovered sleep for 3h．Controls were
通讯作者：宿长军(1964-),男,吉林白城市人,博士,副主任医师,副教授,从事神经病学及睡眠医学专业,Tel:029-84777643, E-mail:tdneurob@fmmu.edu.cn
housed in the normal cage and on the large platforms over water．There were 3 rats in each group.
The effects of sleep deprivation and sleep recovery on the expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP) and Fos protein were investigated by immunohistochemistry．Result The expressions of GFAP and Fos were increased obviously at SCN after sleep deprivation, where both of them were depressed after sleep recovery and the tendencies of their changes almost at equal pace．Conclusion It is possible that the astrocytes regulate sleep together with neurons．
Key words: sleep deprivation；SCN；astrocyte；GFAP；Fos；rat

0 引言
睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）即限制受试者的睡眠时间至正常需要量以下，常被作为一种有效的研究睡眠机制的手段。关于SD后神经胶质细胞的反应及其与神经元的关系研究地较少。近年研究发现星形胶质细胞（astrocyte，AS）具有对多种疾病状态作出反应的能力，且和神经元之间具有双向交流机制[1]。视交叉上核（SCN）是日周期节律的控制中心，SD及睡眠恢复（sleep recovery，SR）后SCN的神经胶质细胞有怎样的反应，并与神经元有什么关系目前尚未见报道。本研究采用免疫组织化学的方法，观察大鼠SD24h及SR 3h胶原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）在SCN表达的改变及其与Fos蛋白表达的关系，探讨AS及与神经元在睡眠调节中的作用。
1         材料和方法
1.1    实验动物及分组  成年、雄性、健康上海产Sprague-Damley大鼠12只，体质量180±10g，由第四军医大学实验动物中心提供。采用随机数字表法，每只大鼠分配两位随机数，从小到大排序，每3只一组，对应分配到睡眠剥夺（SD）组，睡眠恢复(SR)组，大平台对照（tank control，TC）组和正常笼养（normal cage，NC）组。
1.2    睡眠剥夺模型的建立  采用小平台水环境法（flower pot）[2]建立大鼠SD模型，制作25.0cm×25.0cm×25.0cm的鼠箱，其中竖一面积为6.4cm×6.4cm、高8.0cm的平台，在鼠箱里注水，水面低于平台面约1.0cm。鼠在平台上可自行饮食饮水，若其睡眠，则由于肌肉张力松弛而跌落水中。大鼠活动空间内采用自然光线，室温在18-22℃。实验前，将每只大鼠每天置于鼠箱内适应环境1小时，持续一周。大平台面积为18.0cm×18.0cm，鼠可在其上睡眠，其余条件相同。SD组、SR组和TC组实验自8：00开始到次日8：00，其中SR组在SD24h后放入笼中恢复睡眠3h。空白对照组单独饲养于笼中，其余条件同上。
1.3 脑组织标本采集  各组大鼠到实验时间点后立即腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉，开胸经升主动脉灌注生理盐水100ml快速冲洗全身组织血液，随后灌注冷的（4℃）4g/L多聚甲醛（由NaOH、多聚甲醛、KH2PO4配制，PH7.4）500ml，先快后慢持续60-90min。灌注结束后取全脑置于20%蔗糖磷酸缓冲液（由蔗糖和0.01mol/LPB配制，PH7.4）中，4℃冰箱保存至组织块沉底。用恒冷箱切片机做连续冠状冰冻切片，片厚30μm，隔5取3，3组切片分别收集于0.01mol/LPBS（由Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.H2O、NaCl、KCl配制，pH7.4）中。
1.4 免疫组织化学染色（ABC法）  室温下，切片先用3g/L TritonX-100液孵育30min。3组切片分别处理如下：
第一组：抗GFAP免疫组化反应（ABC法）：入兔抗GFAP抗体稀释液（1：3000，Sigma）孵育24h；生物素标记的羊抗兔IgG（1：500，Sigma）孵育2h；生物素-卵白素-HRP复合物，ABC（1：500，Sigma）孵育2h；最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法显色。以上每一步骤之后均用0.01mol/LPBS充分漂洗3次，每次10min；DAB显色前后各用蒸馏水快速冲洗脑片3次。
    第二组：抗Fos免疫组化反应（ABC法）：入兔抗Fos抗体稀释液（1：3000，Sigma）孵育24h；生物素标记的羊抗兔IgG（1：500，Sigma）孵育2h；生物素-卵白素-HRP复合物，ABC（1：500，Sigma）孵育2h；最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法显色。以上每一步骤之后均用0.01mol/LPBS充分漂洗3次，每次10min；DAB显色前后各用蒸馏水快速冲洗脑片3次。
第三组：用PBS替代GFAP、Fos抗体，再按ABC法进行免疫组化染色，结果为阴性。
1.5 结果判定  主要采用显微镜下计数每个单侧SCN的Fos及GFAP阳性细胞的数量最后取平均数，并结合细胞形态的改变如细胞深染、胞体变大和突起变粗来判定。具体判断标准：60个以上为极强阳性(++++), 40-59为强阳性(+++), 20-39为阳性(++), 5-19为(+), <5个为阴性（-）。
2  结果
（附照片(略)）
2.1 NC组  发现少量Fos神经元和GFAP星形胶质细胞，Fos神经元着色浅淡；AS的特点是胞体小，突起细。
2.2 TC组  Fos神经元和GFAP星形胶质细胞较NC组增多，但细胞形态较NC组差异不明显（见图1-B、E）。
2.3 SD组  Fos神经元和GFAP星形胶质细胞明显增多，Fos神经元数目增多且颜色深染（见图1-A）；AS细胞特点是胞体变大,突起增粗增长(见图1-D)。
2.4 SR组  大鼠的行为学表现为放回笼中的3h内近95%的时间在睡觉。免疫组化染色显示Fos神经元和GFAP星形胶质细胞与SD组相比明显减少（见图1-C、F）。
3  讨论
以往的研究证明，下丘脑的SCN是日周期节律的控制中心，摘除双眼而处于自由行走的大鼠，其睡眠白昼多于夜间的节律仍然存在，如再破坏其SCN，这种日周期节律则完全丧失[3]。在体或离体实验均已证实，SCN神经元放电活动呈现周期约为24h的昼夜节律性[4]。
动物SD后中枢神经系统的某些神经元处于一定的兴奋水平。即刻早期基因(Immediate Early Genes，IEGs)在其他组织基因尚未发生变化时便会发生变化，作为“第三信使”起作用。SD后有多种IEG在脑中都会有所表达，其中Fos蛋白同动物的高活动性相关程度最大。O’Hara[5] 曾用5种探针(c-fos、c-jun、junB、NGFI-A和NGFI-B)分别进行标记，它们的表达水平依次为c-fos>NGFI-A=NGFI-B= iunB>c-jun，在表达时程上，c-fos也优于其它几种IEG，并且它同动物的清醒水平也有一定的关系[6] 。已有实验表明SD后，脑中c-Fos蛋白表达发生变化[7]。因此，在试验中，我们选取Fos蛋白免疫组化的方法表示SD对神经元兴奋水平的影响。SD时间的长短也会影响Fos蛋白的表达[8]。SD时间较短时，环境及移动等造成的应激影响还存在且较大[9]，我们选用24h作为SD的时间，此时各种应激的影响就会减少。本实验中大鼠SD24h后，Fos蛋白在SCN表达增强，这同SD破坏动物的正常生物节律有关，同以往的报道相符[9]。本实验中SR组大鼠SCN的Fos蛋白表达水平下降，可能是恢复睡眠期间水解Fos蛋白的通路被激活所致。至于睡眠到底产生什么物质、通过怎样的途径激活蛋白水解酶，尚待进一步研究。
在SCN内除有神经元分布外，还存在大量的神经胶质细胞，主要是AS。GFAP作为AS活化的标志之一已成共识。Ibata[10] 等观察到在SCN 内大量存在神经元-胶质细胞的相互联系。AS呈GFAP反应阳性，其阳性胞体和突起广泛分布于SCN的两亚区并围绕在血管活性肠肽（VIP）和精氨酸-血管加压素（AVP）神经元周围，部分突起在毛细血管周围形成“胶质足板”。有人观察到SCN内AS的突起之间存在缝隙连接。关于SCN内AS的功能尚不清楚。Peterson[11] 等认为AS可能有保护SCN免受神经毒素损害的作用。Morin[12]等则认为AS可能是组成昼夜节律生物钟所不可缺少的一部分。Hsu等发现SD5d后大鼠AS表现为肥大及GFAP免疫反应增强[13]。本实验中大鼠SD24h后SCN的AS表现为颜色深染、胞体变大、突起变长，GFAP反应阳性细胞数增多；SR3h后，GFAP反应阳性细胞数目明显减少且色淡浅染。在SCN的GFAP表达的变化与Fos蛋白的反应趋势相一致，提示SCN的AS可能与神经元共同参与了睡眠调节。我们已发现SD及SR后脑干中分缝核群Fos蛋白与GFAP表达变化趋势一致，推测二者可能作为一种功能复合体在发挥作用[14]。关于神经元与AS作为功能复合体的报道较多，它们共同参与能量代谢及信息的处理与传递[1]。但其具体机制有待进一步研究。
参考文献
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顾汉现

大鼠下丘脑星形胶质细胞对不同时段睡眠剥夺的反应

(转帖)

[摘要]目的：探索不同时段睡眠剥夺后，大鼠下丘脑内星形胶质细胞（AS）的反应与剥夺睡眠时间的时效-量效关系。方法：45只雄性SD大鼠随机分为三组，每组内再分三组：睡眠剥夺（SD）组7只, 采用小环境水平台法建立大鼠睡眠剥夺模型，分别剥夺睡眠3，6，12，24，48，72，96h；与其一一对应的大平台对照（TC）组7只；正常单独笼养（CC）组1只。这样接受同一处理的大鼠各有3只。用免疫组织化学的方法检测胶原纤维酸性蛋白（GFAP）在下丘脑的表达变化。结果：GFAP在下丘脑核群的表达出现随睡眠剥夺时间长短变化的趋势，在视交叉上核和室旁核的表达于24h达到高峰后下降，在弓状核的表达于48h达高峰，在视上核的表达开始即上升，24h达高峰后下降。TC组有些下丘脑核团GFAP表达也有所增强，但未表现出与SD组相似的随时间变化的趋势。结论：SD后视交叉上核GFAP表达增强表明在SD12h后大鼠视交叉上核的AS被激活，SD24h为一个完整的日周期生物节律紊乱，AS表达最高；随着时间延长GFAP表达降低，可认为大鼠视交叉上核对SD后的生物钟节律的重新调整。在弓状核的表达变化说明下丘脑弓状核接受脑干中缝核投射纤维后AS激活并参与对睡眠节律的调节。视上核的GFAP表达说明SD作为一种应激原，视上核AS参与了应激反应。AS在室旁核的表达可认为是对内环境稳态变化的反应。总之可以得出：星形胶质细胞可能参与下丘脑核团的生物节律调节。
[关键词]睡眠剥夺；下丘脑；星形胶质细胞；GFAP；大鼠
[中图号] Q291   [文献标识码] A  
0 引言
下丘脑被认为是睡眠-觉醒节律的中枢发生部位，与神经系统其他部位存在广泛的联系，它作为神经内分泌中心又调控着某些激素的分泌节律。睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）即限制受试者的睡眠时间至正常需要量以下。近年来SD对机体的影响备受人关注，但关于SD与神经胶质细胞关系的研究很少。本研究采用免疫组织化学的方法，观察不同时段SD后下丘脑内GFAP的改变，探讨星形胶质细胞（astrocyte，AS）对SD的反应以及其在睡眠调节中的作用。
1        材料和方法
1.1 材料  成年、雄性、健康上海产Sprague-Dawley大鼠45只，体质量（180±10）g，由第四军医大学实验动物中心提供。将45只大鼠随机分为三组，每组15只又随机分为小平台实验组（sleep deprivation group，SD组）七只，大平台对照组（tank control group，TC组）七只及单独笼养的空白对照组（cage control group，CC组）一只；SD与TC各组内7只大鼠分别随机进行3，6，12，24，48，72和96h睡眠剥夺处理。睡眠剥夺模型的建立，采用小平台水环境法[1]（flower pot）建立大鼠SD模型。
1.2    方法  
1.2.1 脑组织标本采集  各组大鼠到实验时间点后立即腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉，开胸经升主动脉灌注生理盐水100mL快速冲洗全身组织血液，随后灌注冷的（4℃）40g/L多聚甲醛（PH7.4）500mL，先快后慢持续60-90min。灌注结束后取全脑置于200g/L蔗糖磷酸缓冲液（PH7.4）中，4℃冰箱保存至组织块沉底。用恒冷箱切片机做连续冠状冰冻切片，片厚30μm，隔5取1，切片收集于0.01mol/LPBS中。
1.2.2 免疫组织化学染色  切片分为2组：第1组：抗GFAP免疫组化反应（ABC法）：室温下，切片用3g/L TritonX-100液孵育30min；入兔抗GFAP抗体稀释液（1：3000，Sigma）孵育24h；生物素标记的羊抗兔IgG（1：500，Sigma）孵育2h；生物素-卵白素-HRP复合物，ABC（1：500，Sigma）孵育2h；最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法显色。以上每一步骤之后均用0.01mol/LPBS充分漂洗3次，每次10min；DAB显色前后各用蒸馏水快速冲洗脑片3次。第2组：用PBS替代GFAP抗体，再按ABC法进行免疫组化染色，结果为阴性。
1.2.3 结果判定  主要采用显微镜下计数下丘脑各核团GFAP阳性细胞的数量并结合细胞形态的改变如细胞深染、胞体变大和突起变粗来判定。具体判断标准：60个以上为极强阳性(++++), 40-59为强阳性(+++), 20-39为阳性(++), 5-19为(+), <5个为阴性（-）。
2        结果
    图1（见后）显示SD组在实验后，GFAP在下丘脑各个核团的表达均出现随SD时段变化的趋势（图1）。GFAP在交叉上核的表达在SD12～24h达到高峰，以后又降低；在弓状核的表达于48h时最强；在视上核的表达于开始即增强，24h时达高峰，48h后又减弱；在室旁核的表达于24h时略增强。TC组GFAP在各核团的阳性表达也略微增强，但未见明显随时间变化的趋势（表1）。
表1 不同时段SD各组大鼠下丘脑核群GFAP的表达强度
组别/h             交叉上核    弓状核    视上核     室旁核
                    （SCN）    （Arc）   （SO）     （Pa）
SD        3          +         ++         ++         +
            6           +         ++        ++          +
           12          ++         ++        ++          +
           24          ++         ++       +++         ++
           48          +         +++        ++          +
           72          +          ++         +          +
           96          +          ++         +          +
TC        3          +          +         +           -
            6          +          +          +          +
           12          +          +          +          +
           24          +          +          +          +
           48          +          +          +          +
           72          +          +          +          +
           96          +          +          +          +
CC                   +          +          +           -

3  讨论
下丘脑是较高级的调节内脏活动的中枢，调节体温、营养摄取、水平衡、内分泌、情绪反应、生物节律等生理过程。视交叉上核是日周期节律的控制中心，摘除双眼而处于自由行走的大鼠，其睡眠白昼多于夜间的节律仍然存在，如再破坏其视交叉上核，这种日周期节律则完全丧失[2]。在体或离体实验均已证实，视交叉上核神经元放电活动呈现周期约为24h的昼夜节律性[3]。本实验观察到，SD后第一天，视交叉上核GFAP表达增强（特别是SD12~24h），以后又减弱，这表明在SD12h后大鼠视交
叉上核的AS被激活，SD24h为一个完整的日周期生物节律紊乱，AS表达最高；SD24~96h, GFAP表达降低，可认为大鼠视交叉上核对SD后的生物钟节律的重新调整。可得出结论：一，AS参与睡眠
调节，这与文献报道一致[4，5]；二，SD使动物生物节律改变，这也与文献一致[6]。弓状核接受中缝核内5-HT能神经元的部分纤维投射[7]，5-HT能神经元的胞体主要集中在中缝核群，中缝核吻侧5-HT递质系统受中脑网状激动系统的驱动，涉及睡眠的发生和慢波睡眠的维持，SD可增加中缝核5-HT能神经元阳性率，使该系统活动增强，而后者又可反馈抑制网状激动系统的作用[8]。另外我们在SD后亦发现脑干中缝核的GFAP阳性表达以及随时间变化的规律性[4]，说明在下丘脑和脑干中缝核之间的联系参与SD后的一系列生理反应。本实验中弓状核在SD 48h时GFAP表达最强而后减弱的现象，说明下丘脑弓状核接受脑干中缝核投射纤维后，AS激活并参与对睡眠节律的调节。视上核主分泌垂体加压素，对血压和渗透压的调节发挥重要作用[9]。本实验中视上核GFAP表达在SD一开始即升高，24h达高峰而后降低，说明SD作为一种应激原，视上核AS参与了应激反应。室旁核不仅与视上核通过分泌抗利尿激素调节机体水平衡而且含有许多促肾上腺皮质激素释放激素神经元，因此它既有神经内分泌功能，又有典型的神经调节作用[10]。本实验中AS在室旁核的表达于24h时略增强，可认为是对内环境稳态变化的反应。
    尽管有些下丘脑核团在TC组GFAP表达也有所增强，但未表现出与SD组相似的随时间变化的趋势，可认为由于活动限制及隔离使大鼠的神经内分泌调节轻微改变所致。从本实验结果可以看出，不同时段SD对大鼠下丘脑核群AS的表达存在不同影响，故认为AS可能参与下丘脑核团生物节律的调节。但AS是以哪种方式参与睡眠调节的呢？SD后AS以哪种途径与神经元进行信息交流呢？具体机制有待进一步研究。  
[参考文献]
[1] Youngblood BD，Zhon J，Smagin GN，et al. Sleep deprivation by the“Flower Pot”technique and spatial reference memory[J]. Physiol Behav，1997;2:249-256.
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