细胞:科学家绘制肿瘤免疫细胞图集 免疫巨噬TNK胞早期损

邓文龙

作者：Miriam Merad

来源：《细胞》

发布时间：2017/5/10 13:42:42

科学家绘制肿瘤免疫细胞图集  



图片来源：《细胞》

近日，发表在《细胞》杂志上的两项独立研究描绘了围绕肿瘤的免疫细胞明细图。其中一个研究组——瑞士苏黎世大学等机构的科学家，对肾癌进行了研究。结果发现，临床结果不同的肿瘤具有独特的免疫细胞图谱。这些图谱也能估计一个癌症患者的预后。而来自美国的研究组对肺癌进行了研究。结果发现，早期肿瘤会扰乱免疫细胞的活性。这些发现有望帮助开发更精准的癌症免疫疗法。

“我们发现，免疫细胞在肿瘤形成非常早期时就开始功能失调了。但癌症免疫疗法通常在患者病情复发和癌症晚期才被使用。我们希望倡导在癌症更早阶段就开始使用免疫治疗，以免为时过晚。”该研究的通讯作者、西奈山医学院肺癌学家Miriam Merad说。而苏黎世大学肾癌专家Bernd Bodenmiller表示，了解不同患者肿瘤之间的免疫细胞差异为开发个性化的免疫疗法带来了更大可能性。

肿瘤不受抑制的生长能力得益于它对免疫细胞的招募。它们形成了微型生态系统。在这一系统中，细胞与细胞之间的关系在正常组织中是见不到的。新免疫细胞图谱揭示了这些生态系统。

在两项研究中，科学家用30至40个抗体标记了肿瘤周围的单个免疫细胞生成图谱。利用这些信息，科学家借助一种检测器筛选细胞，并揭示它们的“身份”以及这些细胞是功能性的或者是有缺陷的。

Bodenmiller研究组调查了73名肾细胞癌患者的肿瘤样本。结果显示，其中的T细胞和巨噬细胞的数量比先前认为的更多变。研究小组还发现，一些拥有T细胞和巨噬细胞特定组合的患者倾向于产生快速发展的癌症。

Merad 等人调查了28名早期或晚期肺腺癌患者的肿瘤样本和正常组织。他们观察到的细胞行为变化比预期的要早得多。Ⅰ期肿瘤已经显示出大量抑制性巨噬细胞和T细胞的聚集以及NIK细胞的损耗。这些肿瘤通常通过手术切除，虽然它们预后良好，但仍有25% 的患者复发。（中文来源：中国科学报 唐一尘）

http://paper.sciencenet.cn/htmlpaper/201751013424279443884.shtm

http://www.sciencedirect.com/sci ... i/S0092867417304270

http://www.cell.com/cell/fulltex ... 70%3Fshowall%3Dtrue



（華成旅行最便宜 03-3833-9823)

邓文龙

软件译：

资源

通过配对单细胞分析在早期肺腺癌中的先天免疫风景

Yonit Lavin， Soma Kobayashi 14， 安德鲁领袖14， 大卫·阿米尔， 纳马·莱芬， 卡米尔·本根瓦尔德， 罗曼笔记13， 罗伯特·斯威尼， 克里斯汀·贝克尔， 雅各布·莱文， 克劳斯·梅恩霍夫（Klaus Meinhof）， 周星驰， Seunghee Kim-Shulze， 安德烈·沃尔夫， Chiara Medaglia， 韩杰杰， 朱莉A. Rytlewski， 赖恩·艾默生， 亚历山大·索洛维夫夫， 本杰明·格林鲍姆， 凯瑟琳·桑德斯， 玛丽莎·维尼亚利， 玛丽·贝丝·比斯利， 拉贾弗洛雷斯， Sacha Gnjatic， 达娜·佩尔， 阿迪·拉赫曼， Ido Amit， Miriam Merad 15 ，关于作者的信件信息Miriam Merad 通过电子邮件发送作者Miriam Merad“
13 现在的地址：法国马赛，13009号，德拉马西大道117号的Innate Pharma
14 这些作者贡献同等
15 主要联系人
DOI：http : //dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.04.014 |
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•配对分析显示独特的TNM阶段独特的肿瘤免疫标记
•CD141 + DC的消耗和PPARγ的富集喜巨噬细胞在早期肺癌
•早期肺癌NK细胞减少和受损
•使用TIM隔室可有助于增强T细胞免疫疗法
概要
为了指导早期肺肿瘤患者的免疫治疗策略的设计，我们制定了多尺度免疫分析策略，以绘制早期肺腺癌病变的免疫景观，以寻找肿瘤驱动的免疫变化。我们利用一种条形码方法，可以对肿瘤，非参与肺和血细胞进行同时单细胞分析，我们提供了早期肺肿瘤的详细的免疫细胞图谱。我们显示I期肺腺癌病变已经存在显着改变的T细胞和NK细胞区室。此外，我们确定了可能损害抗肿瘤T细胞免疫的肿瘤浸润性骨髓细胞（TIM）亚群的变化。配对的单细胞分析因此提供了肿瘤驱动的免疫变化的宝贵知识，为免疫治疗的合理设计提供了有力的工具。

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介绍
目前的检查点封锁疗法主要用于挽救T细胞，以减少T细胞的消耗或消耗T细胞（Treg）。研究已经开始解剖晚期肿瘤病变中T细胞功能和分布的细节，以鉴定进一步加强抗肿瘤T细胞免疫的新策略。骨髓细胞通过其向T细胞呈递肿瘤相关抗原并产生关键T细胞分化细胞因子的能力具有控制肿瘤部位T细胞功能的独特能力。然而，对于肿瘤部位的髓样隔室的多样性而言，更为众所周知。

骨髓细胞是免疫细胞的多样化群体，其共享通过清除受损细胞的感觉和反应组织损伤的能力，并通过促进免疫效应细胞的募集来帮助恢复组织完整性（Lavin和Merad，2013，Pham，2006） 。肿瘤浸润性骨髓细胞（TIM）由分化不同阶段的粒细胞和单核吞噬细胞组成，已被证明有助于肿瘤进展和治疗反应（Engblom等，2016，Gabrilovich等，2012）。其中，单核吞噬细胞是指单核细胞，巨噬细胞和树突状细胞（DC），除了其先天免疫功能外，它们分享向T细胞呈递肿瘤相关抗原的能力（Ginhoux和Jung，2014）。在TIM中，DC是驱动T细胞激活的最佳装备（Merad等，2013），并且显示了称为CD103 + DC的DC的一个子集，以控制局部CD8 + T细胞的活化（Broz等，2014，Hildner et al。，2008，Salmon et al。，2016，Sánchez-Paulete et al。，2016）。因此，TIM组合似乎控制肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）组合物，激活和抗肿瘤功能，并且利用TIM隔室可以提供强大的协同策略来增强T细胞靶向免疫疗法。

目前，大多数肺癌病例都被诊断为晚期。然而，这可能会发生变化，因为处于危险人群中的低剂量CT筛查程序已经显示出益处并被广泛实施（Aberle et al。，2011，Black et al。，2015）。病理分期IA和IB非小细胞肺癌（NSCLC）患者的五年生存率分别仅为83％和71％，这些数字下降到第二阶段疾病的50％（Goldstraw et al。，2016），辅助化疗的改善程度最小（Pignon et al。，2008）。初步数据表明，在抗PD-1 mAb阻断治疗的少数早期可切除肺NSCLC病变中，新辅助免疫治疗的活动令人印象深刻（Forde等，2016）。尽管这些研究需要在更大的队列中得到证实，但这些结果与免疫治疗剂在低肿瘤负荷下和最初免疫调节化疗药物患者中最有效的概念一致。然而，用于治疗NSCLC的免疫调节策略的设计将非常受益于对针对肿瘤提示特异性发展的免疫细胞景观的详细了解。

为此，我们开发了一种多尺度免疫分析策略，以绘制早期肺腺癌病变的免疫微环境。由于组织线索显着影响组织常驻免疫细胞和特异性先天细胞的生物学（Lavin等，2014），我们设计了一种条形码策略，其允许同时存在于肿瘤中的不同免疫细胞区室的单细胞分析现场，非参与肺组织（nLung）和每位患者的血液，以区分肿瘤驱动的免疫特征与正常组织印记线索引起的免疫特征。通过与飞行时间（CyTOF）结合单细胞转录组学和多发性组织成像肺肿瘤的细胞计数，我们确定NK和骨髓细胞反应是肿瘤病变独特的，不存在来自同一患者的nLung或血液。我们显示这些变化早在I期肿瘤中就可以出现，并且可能危及抗肿瘤免疫。这些数据表明，针对早期肺腺癌病变中先天免疫细胞的新辅助免疫治疗策略有可能重新激活TIL微环境，并将肿瘤反应转变为检查点封锁。

结果
肺肿瘤的高维单细胞谱分析
为了绘制肺腺癌病变的免疫微环境，我们设计了新鲜切除肿瘤的临床多尺度免疫分析研究。选择的患者在手术时天天治疗。对于每个患者，我们获得NSCLC肿瘤组织，包括侵袭性边缘，肺组织和血细胞（图 1A; STAR方法）。32例患者中，28例确诊为肺腺癌。患者代表年龄，性别，突变状态和主要组织学亚型的肺腺癌分布（表S1）。

为了区分肿瘤特异性免疫变化与肺组织免疫环境，我们试图同时绘制肺肿瘤病变，肺组织和外周血的免疫区域。为此，我们开发了一种新颖的条形码方法，允许同时分析来自所有三种样品类型的细胞。在第一个18名患者队列中，在收集样品之前，从肿瘤损伤，nLung和血液分离的免疫细胞用抗CD45抗体（Ab）与独特的金属同位素缀合。然后将合并的样品用两组超过30种抗体染色，并通过CyTOF分析，从而允许测量每个患者每种组织类型中存在的免疫细胞上的单细胞表达（图 1A）。随后将星形细胞计数板扩展到包括10个额外的肺腺癌患者队列中的细胞因子测量，如STAR方法中所述。

T细胞和单核吞噬细胞主导早期肺腺癌微环境
我们分析了不同免疫细胞系在肺肿瘤病变，肺癌和血液循环中的分布情况，分析了不同免疫细胞谱系的分布情况，利用viSNE可以观察二维高维数据，同时保持了单细胞分辨率（Amir et al。，2013） （表S1和数据S1）。与nLung相比，肿瘤组织中积累的免疫细胞数量较多（图 S1A ）。包括所有主要的免疫谱系的肿瘤驻留的免疫细胞区室，和最丰富的是在T淋巴细胞和单核吞噬细胞（图1的B-1D和S1 B）。与nLung相比，单核吞噬细胞和粒细胞与肿瘤病变相同。相反，T和B淋巴细胞存在于比nLung肿瘤微环境更高的频率，而NK细胞的频率在所有肺腺癌患者中降低显著检查（图1 C，1D和S1 C）。

我们还分析了肿瘤环境中产生的细胞因子和趋化因子。尽管与血液相比，许多趋化因子和细胞因子在肿瘤中以高得多的水平表达，但在肿瘤和相邻的nLung中常常检测到类似的趋化因子水平，这可能潜在地反映肿瘤产生的可溶性分子到相邻肺组织的局部扩散（图 S1D和S1E）。有趣的是，与nLung相比，CX3CL1（fractalkine）在肿瘤中表达略高，与单核吞噬细胞浸润的频率相关（图 S1F ）。

最近的研究表明，除了细胞组成外，免疫细胞在肿瘤部位的空间分布可能会影响肿瘤的结果（Germain等，2014）。使用名为“在单个幻灯片多路复用免疫连续染色”（MICSSS）的新组织性能测试方法，我们在实验室最近开发（备注等人，2016），我们评估免疫细胞在肿瘤和nLung部分分布。免疫细胞主要积累在基质和如先前所描述肿瘤周围的胰岛浸润性裕度（鲑鱼等人，2012，特利等人，2015），尽管一些巨噬细胞和T细胞能够渗透到肿瘤（图1 Ë和S1I）。我们还观察到单核吞噬细胞和T细胞的丰富在肿瘤部位跨越支撑CyTOF结果例（图1 D，1E，及S1 B）。重要的是，许多患者具有三级淋巴结构（TLS），其累积附近的肿瘤浸润性裕度和缺席从nLung（图1 F和S1 I）。在肿瘤部位通过CyTOF测量，富集TLS的肿瘤病变具有显着更多的T淋巴细胞和较少的单核吞噬细胞（图 S1H ）。

为了进一步探索在肿瘤部位诱导的免疫应答的性质，我们使用Phenograph算法分析了CyTOF数据，以系统地鉴定三个组织和所有患者的常见细胞群落（Levine等，2015） 。我们首先基于肿瘤病变上的共享蛋白质表达聚集单细胞，每个患者中的nLung和外周血单核细胞（PBMC），然后使用二次聚类分析来合并来自每个患者的簇，以鉴定跨患者和组织共有的元簇（图 1A ）。

肿瘤病变在Treg和非功能性T细胞中富集
跨组织和在所有患者Phenograph聚类显示不同T淋巴metaclusters（图2 A，2B和  S2的A），对应于已知的免疫细胞群和具有跨组织部位（中的独特分布图2 C和S2 B）。

成对的质量流式细胞术分析显示T细胞亚群（的不同组成和表型图2 C和S2 B）。具体来说，即使在早期阶段，所有患者的肿瘤病变Treg明显增加（图 2C）。重要的是，调节性T细胞在肿瘤位点相比其他T细胞（表达高水平的CTLA4，CD39，ICOS，和41BB的图2 D和S2 D）。他们还清楚地区别于的Treg在nLung居住基于Foxp3的，CTLA4，PD-1，CD39，ICOS，CD38，和41BB的更高表达，而CCR4降低（图2 E，S2 E，和S2F）。相比之下，与nLung和来自相同患者的血液相比，细胞溶解性CD8 + T细胞在肿瘤中的频率显着降低（图 2C）。此外，与其nLung对应物相比，存在于肿瘤中的总CD8 + T细胞在刺激时表达明显较少的颗粒酶B和IFNγ（图 S2G ）。因此，降低的T细胞/ Treg比率是肺肿瘤病变的强烈特征（图 S2C ）。

鉴于肺癌患者抗PD-1检查点封堵的成功，我们检查了检测点分子PD-1在组织中鉴定的所有T细胞元集群上的表达。PD-1在CD4 +和CD8 + T细胞的一小部分上明显表达，这是CD4 +和CD8 + T细胞的独特特征（图 2C和S2H），在肿瘤位点的Treg较低水平（图 2D）。CD8 + T细胞中累积在肿瘤部位并且在TLS，在那里它们优先扩大（图2 F和S2 I; 。戈奇等人，2014，。Joshi等人，2015），和T细胞受体的克隆（TCR）剧目已经与TLS密度相关（Zhu et al。，2015）。与这些发现一致，T细胞在富含TLS的肿瘤中显着增加（图 S1H ）。此外，虽然与nLung相比，肿瘤中TCR克隆性没有丰富，但CD8 + PD-1 + T细胞亚群与肿瘤部位增加的TCR克隆性独特且显着相关，但不在nLung（图2 G和S2 J） 。这些结果表明，表达PD-1的CD8 + T细胞在肿瘤部位被克隆扩增，并且该扩增可能优先发生在富含TLS的肿瘤病变中。

细胞因子NK细胞被排除于肺腺癌病变
除了测量对肿瘤的适应性淋巴细胞反应外，我们还分析了先天性淋巴细胞，特别是NK细胞在肺肿瘤病变中的分布。引人注目的是，与nLung相比，NK细胞是肺腺癌病变中免疫细胞谱系中最少的（图 1C和1D）。重要的是，表达CD16的NK细胞亚组中肿瘤被最显着地减少相比nLung（图3 A和  S3 A）。渗透肿瘤损伤的NK细胞表达更高的CXCR3水平，这是NK细胞浸润肿瘤所需的分子（图 3B和3C; Wendel等，2008）。而且，保持在肿瘤部位NK细胞的溶细胞较少，因为它们表达粒酶B和CD57的水平较低以及更少IFNγ（图3的C-3E和S3 C）。相反，由于NK细胞起到消除MHC I类缺陷细胞的作用，我们使用MICSSS评估了MHC I类遍及肿瘤细胞的分布（图 3F ）。肿瘤病灶与MHC I类表达的肿瘤细胞中的降低的频率具有肿瘤浸润CD16 + NK细胞的较高的数字，这表明细胞溶解NK细胞的存在可能导致MHC I类免疫编辑（图3 G和S3 ð ）。

破译肺腺癌病变中TIM的多样性
为了完全捕获TIM隔室的异质性，我们首先对使用大规模平行单细胞RNA测序的肿瘤病变和I期患者的nLung中积累的非淋巴细胞转录因子进行了无偏的单细胞转录组学分析MARS-seq; 图4A ; 数据S2B ; STAR方法 ; Jaitin等，2014）。使用先前描述的无偏倚期望最大化算法（STAR Methods ; Paul et al。，2015）的TIM富集细胞的单细胞RNA-seq分析揭示了基于根据高度鉴定的特征基因表达谱分类的几种免疫细胞类型表达和差异基因（图4A ; 表S3）。具体而言，我们确定了三个不同的集群中表达高水平的MHC II类分子，CD1C，CCL22，和CD207（图4 A，集群2-4）和稍高BATF3和CSF2RA的表达水平（图4 E和S4 A），其我们推断是DC。其它簇被鉴定为巨噬细胞（图4 A，集群5-8）和基于所述差异表达的单核细胞（簇9-10）CD68，MAFB，和CSF1R（图4 E和S4 A）。主要由来自肿瘤病变（第7组）的细胞组成的巨噬细胞簇与主要来自nLung（簇5-6）的细胞不同，表明肿瘤相关巨噬细胞与其永久存在的巨噬细胞相似物是不同的。

为了详细了解患者的TIM隔室，我们通过对PBMC，nLung和肿瘤免疫细胞进行同步CyTOF分析系统地定义了患者的骨髓细胞群体。所有患者所有组织的斑点聚类证实了肿瘤中骨髓细胞的多样性，并且基于蛋白质标志物（包括CD68，CSF1-R，CSF2-R，CD11C，CD1C）的表达鉴定了巨噬细胞，DC亚群和单核细胞亚群，CD141和HLA-DR等（图 4B，4C，4E和S4B）。TIM与肺和PBMC对应物不同（图 4D和S4C）。事实上，成对的CyTOF分析揭示独特分布和CD14 +和在肿瘤部位CD16 +单核细胞亚群的功能（图4 D和S4 D）。虽然CD14 +单核细胞相对于其它单核吞噬细胞（分别为稳健的细胞因子生产图4女，S4 E，和S4F），它们产生较少的IL-8和少IL-1β在肿瘤部位相比nLung（图4 G和S4 ģ ）。与此相反的CD14 +单核细胞同等地浸润肿瘤和肺组织中，CD16 +单核细胞在肿瘤组织进行显著降低，与在肿瘤部位（NK细胞浸润高度相关的图4 D，S4 D，和S3 B）。

最后，虽然与nLung相比，肿瘤损伤同样富集嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，但它们含有显着较少的嗜碱性粒细胞，并且肥大细胞被强烈耗尽（图 4D）。



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邓文龙

配对免疫细胞图谱显示肺腺癌中独特的巨噬细胞标志
单细胞转录组分析显示不同的巨噬细胞簇在肿瘤和nLung中差异分布（图4A，组5-8）。将富含肿瘤（第7组）的巨噬细胞簇与主要由nLung细胞组成的巨噬细胞群（簇5和6）进行比较，发现许多差异表达的基因，表明肿瘤相关巨噬细胞具有不同的转录特征（图 5B ）。

使用成对CyTOF分析，我们发现，尽管巨噬细胞未在频率富集相比nLung肿瘤部位（图5 A和S5 A），肿瘤的巨噬细胞相比，在所有患者的肺驻留同行（表现出不同的签名图5 C和5D）。CyTOF分析验证了几种单细胞转录组学检查结果，证实肿瘤巨噬细胞表达较高水平的免疫调节转录因子PPARγ; 较高的CD64，CD14和CD11c水平; 并且与存在于nLung中的巨噬细胞相比，CD86和CD206水平降低（图 5D）。

单细胞转录分析鉴定了与其nLung对应物（第7组）相比，在肿瘤巨噬细胞簇上上调的其他转录物，包括在骨髓细胞-2（TREM2），四糖蛋白CD81，胶原结构巨噬细胞受体（MARCO）上表达的触发受体，，和载脂蛋白E（APOE ; 图 5B ）。为了了解这种差异转录特征是否扩展到其他患者，我们根据差异转录谱从TCGA数据库分层了515例肺腺癌患者。在具有高巨噬细胞比例与肺巨噬细胞基因表达谱的患者中观察到显着的生存缺陷（图 S5G），表明本研究中鉴定的巨噬细胞标记可能包括肺癌治疗的新型骨髓靶标。

鉴于PD-L1在肺癌中的临床成功（Besse et al。，2015，Fehrenbacher et al。，2016），我们使用配对的质粒细胞分析法检测了肺癌肿瘤病变中PD-L1的分布。引人注目的是，PD-L1被最高度上的巨噬细胞和肥大细胞都在肿瘤和nLung（表示图5 E，S5 B，和S5C）。这些结果与我们在小鼠中的数据（数据未显示）一致，并表明PD-L1在肺免疫稳态的生理调节中的潜在作用，这可以解释PD-L1抑制剂治疗患者肺炎的增加率Naidoo等，2017，Nishino等，2016）。鉴于PD-L1对肿瘤结果+细胞的影响，我们分析了PD-L1的空间分布+巨噬细胞，发现它们在紧簇积累在肿瘤侵入性裕度（图5 E和S5 D）和与T细胞浸润呈负相关在肿瘤病变，但不在nLung（图 S5E ）。

肿瘤的巨噬细胞也自发产生显著更多的IL-6相比，巨噬细胞nLung（图5 F和S5 F）。鉴于IL-6在肿瘤侵袭中的潜在作用（Chang等，2013，Yu et al。，2014）以及肿瘤部位巨噬细胞和T细胞存在之间的负相关性，这些数据强调了免疫抑制作用早期肺腺癌病变组织沉积巨噬细胞。

CD141 + DC具有独特的表型，不包括肺肿瘤
DC优于抗原呈递，并在诱导抗肿瘤T细胞免疫中起关键作用。肿瘤和nLung的单细胞转录分析揭示了两个DC簇的存在（图4中 A，簇2和4），其中的一个表示高CD207，CLEC9A和XCR1水平和可能代表CD141 + DC（Dutertre等。 ，2014，Haniffa et al。，2013）。我们还检测到第二DC簇表达更高水平的CD1C，CX3CR1和IRF4，我们推断为CD1C + DC（图6 A，6B和S6 B）。CD1c + DC簇也表达较高水平的CCL22和CCL17，CCR4的配体，主要由CD4 + T细胞表达的分子（Yoshie 和Matsushima，2015）以及与CD141 + DC相比较高的溶菌酶转录物（图 6B ）。与CD8 + T细胞优先相互作用的CD141 + DC相反，这些发现与CD4 + T细胞相互作用的能力增强和CD1c + DC的降解潜力增加（Dutertre et al。，2014，Haniffa et al。，2013，Merad等，2013）。编码对二级淋巴器官和潜在的TLS形成重要的膜结合蛋白（Pitzalis等，2014）的淋巴毒素β（LTB）转录物被DC高度表达，并且由CD141 + DC簇稍高一些（图6 E）。

配对的CyTOF分析确定了在患者的肿瘤部位存在两个DC亚类。引人注目的是，CD141 + DC，但不CD1C + DC，被显著肿瘤相比减少nLung，并且CD1C + DC / CD141 + DC比在肿瘤病灶由此增加（图6 C，S6 A和S6C）。重要的是，CD1c + DC表达与CD14 +单核细胞非常相似的细胞因子分布，并在肿瘤和nLung中产生IL-6，IL-8和IL-1β细胞因子（图 S4E ）。使用MICSSS，我们发现，在病变TLS，DC定位在TLS和接近T细胞浸润（图6 D和S6 D），在与它们在T细胞活化和克隆扩增（作用线妙-Nosjean等。 ，2008）。

肺腺癌具有与TNM分期无关的独特免疫特征
总之，我们的研究结果建立了早期未治疗的肺腺癌病变的免疫细胞图谱。我们表明，这些病变中PPARγ富集喜 CD64 喜 CD14 喜 PPARγ 喜 IL-6 。在巨噬细胞，CD1C + DC，调节性T细胞，和耗尽T细胞和耗尽CD141 + DC，CD16 +单核细胞，NK细胞，和粒酶B +效应细胞（的图6 F和S6 E）。与nLung相比，这些差异可能协调一致地促进免疫抑制微环境。

由于TNM分期用于确定预后和治疗方案，我们检查了早期（I期）和晚期肿瘤（II期和III期）肿瘤病变的免疫结构是否显着不同。除了II期和III期患者的嗜中性粒细胞和TNFα产生增加外（图6 G），后期肿瘤病变中检测到的所有免疫变化已经存在于I期肿瘤中。免疫细胞亚群，包括巨噬细胞，单核细胞，NK细胞和DC以及B和T细胞亚群的分布没有显著在频率跨级（不同图6 F和S6 F）。此外，PDM-1和PD-L1在巨噬细胞和T细胞上的表达水平分别在TNM期均稳定（图 S6G和S6H），表明免疫调节策略可有益于早期肿瘤。

讨论
在骨髓细胞分离区和最具体地，肿瘤浸润性抗原呈递细胞成为抗肿瘤T细胞组成的前提下，本研究的目的是提供早期肺腺癌病变的先天免疫细胞图谱。使用配对的单细胞分析，存在于肿瘤，nLung和外周血中的免疫细胞，我们将由肿瘤病变驱动的免疫变化与肺组织驱动的免疫细胞区分开来，强调了这种分析对于研究肿瘤微环境。

令人瞩目的是，早在I期疾病中，与nLung相比，肺腺癌病变的CD8 + T效应物/ Treg比值大大降低。这个改变的T细胞比率导致从表达粒酶B和IFNγ和也从CD39的显著膨胀显著降低CD8 + T细胞的喜 CD38 喜 PD-1 喜 CTLA4 喜 Foxp3的喜在肿瘤部位的Treg。与以前的结果显示，Foxp3 / CD3比率是早期肿瘤复发的强烈预测因子（Suzuki et al。，2013），减少CD8 +粒酶B + / CD39 hi CD38 hi PD-1 hi CTLA4 hi Foxp3 hi Treg比例可用作疾病过程或治疗反应的精制生物标志物。

伴随着肿瘤CD16 + NK细胞显着改变，T细胞肿瘤的特征伴随着肿瘤的显着改变，与肺NK细胞相比，少量剩余的NK细胞表现出较低水平的粒酶B和较少的IFNγ。因此，肿瘤浸润的NK细胞溶细性差，NK细胞的扩增或活化可以提供恢复早期肺肿瘤中抗肿瘤免疫的策略。

引人注目的是，我们还发现TNM分期存在于肺腺癌肿瘤病变中的所有抗原呈递细胞亚群的明显变化。具体来说，早在第一阶段，肺腺癌病变在CD141 + DC中明显减少，并且在巨噬细胞中富集PPARγ 。单核细胞包括两个主要亚组，CD16 +和CD14 +单核细胞亚群，显示在组织中具有不同的命运和功能（Yona和Jung，2010）。CD16 +单核细胞，但不是CD14 +单核细胞，在肿瘤部位强烈减少，与肿瘤中CD16 + NK细胞减少显着相关。有趣的是，CD16 +单核细胞已显示促进肿瘤NK细胞募集（Hanna et al。，2015），因此肺肿瘤中减少的CD16 +单核细胞可能导致NK细胞在肿瘤病变中的不足。CD14 +单核细胞在肿瘤中产生高水平的细胞因子IL-8，但是在nLung中产生的更多。IL-8可以促进肺癌的生长和转移（Chen et al。，2003，Zhu et al。，2004），而在吸烟者中，非肿瘤肺组织中IL-8的表达是肺癌生物标志物签名（Spira et al。，2007）。鉴于单核细胞在肺转移中的潜在作用（Qian et al。，2011），nLung中单核细胞衍生的IL-8可能有助于肿瘤细胞移植。有趣的是，虽然我们发现与血液相比，肿瘤组织中细胞因子产生的急剧增加，但许多细胞因子在肿瘤和nLung中同样表达。然而，CX3CL1倾向于在肿瘤部位的较高水平表达，并且与肿瘤病变中的单核吞噬细胞，特别是CD14 +单核细胞显着相关。发现CX3CL1在未能对PD-1作出反应的患者中增加（Herbst et al。，2014）。因此，进一步评估CX3CL1和CD14 +单核细胞作为治疗反应的生物标志物将是重要的。

组织居民DC由转录和功能不同的两个主要亚组组成。在小鼠组织中，这些包括衍生自DC限制性前体的CD103 + DC亚群，并且在CD8 + T细胞的交叉表达和引发方面表现优异，CD11b + DC亚型具有比CD103 + DC更高的降解潜力，并且主要相互作用与CD4 + T细胞（Merad等，2013）。人类CD141 + DC和CD1c + DC分别与鼠CD103 + DC和CD11b + DC分享相似的转录谱，并被认为代表其人类对应物（Dutertre et al。，2014，Haniffa et al。，2013）。

我们和其他人发现CD103 + DC的缺失消除了肿瘤对实验肿瘤模型检查点阻断的反应，而CD103 + DC的扩增和激活显着增加了T细胞募集到肿瘤部位，并且对检查点的封闭进行了转化（Broz等，2014，Hildner等人，2008，Roberts等人，2016，Salmon等人，2016，Sánchez-Paulete等，2016）。在这里，我们发现早期肺腺癌肿瘤与nLung相比CD141 + DC明显减少，而CD1c + DC在肿瘤中略有增加，导致肿瘤部位的CD1c + / CD141 + DC比值升高。

我们还发现肿瘤CD1c + DC与单核细胞具有相同的先天细胞因子特征，与CD1c + DC可能代表在肿瘤部位进入时产生的单核细胞衍生细胞的观念一致，而CD141 + DC被认为是由DC限制性前体引起的Dutertre et al。，2014，Haniffa et al。，2013）。有趣的是，与T细胞激活和克隆扩增中的潜在关键作用相一致，DC在局部接近于T细胞，这与Dieu-Nosjean等人，2008）有关。最近已经证明DC衍生的LT直接作用于高内皮小静脉（HEV），以促进体内淋巴细胞归巢到外周淋巴结（Moussion和Girard，2011）。我们发现DC，特别是CD141 + DC亚型在肺肿瘤组织中表达淋巴毒素β（LTB）转录物可能反映CD141 + DC有可能通过HEV介导的淋巴细胞募集而形成TLS。这一假设与我们的发现相一致，认为TLS富集的肿瘤具有增加的T细胞，并且加强了通过DC-LAMP免疫染色鉴定时TLS所赋予的阳性预后价值的机理理解（Dieu-Nosjean等，2008，Germain et al。2014年，Pitzalis等人，2014）。总之，这些结果表明肿瘤内CD141 + DC的扩增可能是诱导有效的抗肿瘤免疫的关键策略。

重要的是，虽然与nLung相比，巨噬细胞在肿瘤病变中不富集，但与nLung的巨噬细胞相比，肿瘤巨噬细胞表达了独特的表型。特别地，肿瘤巨噬细胞表达更高水平的PPARγ，已知的驱动免疫抑制程序的转录因子（Reddy，2008，Ricote等，1998）和较低水平的共刺激分子CD86。他们还产生更高水平的IL-6，表明这些肿瘤巨噬细胞是致瘤性的。与肺巨噬细胞相比，认为代表活化的巨噬细胞和肿瘤巨噬细胞的标志物的CD206以较低或相似的水平表达，与最近的数据显示CD206是肺泡巨噬细胞的标志物（Desch等人， 2016，Yu et al。，2016）。这强调了配对分析以区分肿瘤驱动的免疫变化与正常组织印记的重要性。骨髓细胞的单细胞转录组学分析进一步扩展了这些结果，并确定了肿瘤巨噬细胞的独特基因特征，其中包括其他基因TREM2，最近显示通过抑制急性病毒感染后的巨噬细胞凋亡来促进慢性肺部疾病（Wu et al ，，2015）。最后，使用多重组织成像，我们确定肿瘤侵入性边缘的PD-L1 +巨噬细胞簇，表明它们对调节T细胞进入肿瘤病变的潜在贡献。因此，增加的巨噬细胞与肿瘤部位的T细胞减少相关，与富含TLS的肿瘤相反，缺乏TLS的病变大部分富集在巨噬细胞中。因此，富集巨噬细胞和减少TLS的肺肿瘤可能特异性地受益于在用检查点封锁治疗之前扩大DC的免疫治疗策略以消耗巨噬细胞。

通过结合多发组织成像和肿瘤，肺癌和血液的成对单细胞分析，本研究提供了早期肺腺癌的详细免疫细胞图谱，并鉴定了特异性T细胞改变，特有的免疫细胞变化肿瘤病变并不存在于nLung。我们鉴定早期肺腺癌病变中重要的先天免疫细胞变化表明，适应恢复先天免疫变化的新佐剂或辅助免疫治疗策略可能独特地成型肿瘤T细胞微环境，并将肿瘤反应转变为检查点封闭。

作者贡献
概念化：MM，YL和CDB; 方法：MM，YL，AR，IA，EDA和JHL; 软件：EDA，AL; 正式分析：YL，AL，EDA，NE，SK，AS，BDG，JAR，ROE，CS，MV; 调查：YL，SK，CB，RS，CM，RR，KM和AR; 资源：RF和AW; 数据整形：SK，CB，RS和CDB; 写作 - 原文：MM，YL，AL和SK; 写作 - 评审与编辑：MM，YL，AL和SK; 可视化：YL，SK和AL; 监督：MM，AR，IA，DP，CDB，SK-S，MBB，SG和AC; 项目管理：MM; 资金收购：MM

致谢
我们感谢Merad实验室的有益的讨论和投入。我们要感谢HélèneSalmon对手稿的批评性审查。我们要感谢人类免疫监测核心（HIMC）在整个项目中的卓越技术支持和援助，特别是Adeeb Rahman和CyTOF核心成员Oksana Mayovska和Victor Guo以及Manishkumar Patel。我们要感谢生物导管与病理核心和流式细胞术设备。我们要感谢吉尔·格雷戈里（Jill Gregory）对艺术作品的帮助。CB由Fund pour la Recherche Medicale DEA20150633125资助。MM由NIH授权R01，R01 CA173861，U19AI128949，U24 AI 118644和U19 AI 117873-01资助。

补充资料
表S1。肺腺癌患者临床特征，与图1相关
表S2。与图1-6相关的CyTOF抗体框，S1-S6Yellow表示细胞内染色
表S3。单细胞基因，与图4-6相关，S4-S6通过簇标准化的平均表达
数据S1。与图1相关的肿瘤，非参与性肺和血液中的免疫应答
viSNE图表示代表性患者中肿瘤，非参与的正常肺组织和外周血单核细胞（PBMC）的指示标记物的最大（红色）至最小（蓝色）的相对表达。
数据S2。FACS门控和附加viSNE图像，与图4F，5F，S3D和S4相关
批量分选和单细胞分选。（A）还显示了CD8 +和CD8-批量分选（顶部）和分选后确认门控的代表性流式细胞术门控（底部）。（B）用于MARS-Seq单细胞分选的代表性流式细胞仪选通。从nLung和肿瘤组织分选CD45 +非T细胞，非B细胞。（C）由28个染色的肿瘤细胞的viSNE表示与来自代表性患者的图4F，5F，S4F和S5F相关的具有细胞群的组3标记。
收稿日期： 2017年1月10日; 收到修订后的形式： 2017年2月26日; 接受日期： 2017年4月11日; 发布时间：2017年5月4日
©2017 Elsevier Inc.
链接文章

http://www.cell.com/cell/fulltex ... 70%3Fshowall%3Dtrue



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