自然:研究揭示最大离子通道RyR1结构 钙通道4x5千多氨基酸

邓文龙

作者：颜宁等

来源：《自然》

发布时间：2014/12/23 13:24:24

研究揭示最大离子通道RyR1结构

14-12月15日，清华大学医学院颜宁研究组与生命学院施一公研究组、以及英国MRC分子生物学实验室Sjors Scheres研究组合作在《自然》（Nature）期刊在线发表题为 “Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution” （兔源RyR1的近原子分辨率结构）的研究长文，揭示了目前已知最大离子通道Ryanodine受体RyR1的三维结构，为理解其功能提供了重要线索。

钙离子是生命体中最为丰富的阳离子之一，也是细胞信号传导中重要的第二信使，参与调控肌肉收缩、细胞分泌、神经信号传递等重要生命过程。在正常情况下，细胞质中的钙离子浓度维持在100 nM左右的低浓度，而内质网（或肌肉组织肌质网）中的钙离子浓度却高达mM级，是细胞内的“钙库”。在肌肉细胞中，当细胞外或者肌质网中的钙离子释放到细胞质时，会引发肌肉的收缩反应。这一过程称为肌肉兴奋收缩偶联，是骨骼肌及心肌运动的分子基础。而负责将钙离子从肌质网快速大量释放到胞浆中的是一种称作Ryanodine受体（Ryanodine Receptor，简称RyR）的高通量钙离子通道。

RyR以四聚体的形式行使功能，每个单体超过5000个氨基酸，因此其四聚体总分子量达到二百三十万道尔顿（2.3 MDa），是目前已知的最大离子通道蛋白。在哺乳动物中有三种RyR蛋白，其中RyR1主要分布在骨骼肌细胞中，RyR2主要分布在心肌细胞中，RyR3则最早在脑细胞中发现，它们在序列上具有高度保守性。RyR的离子通道开关受到包括钙离子浓度在内多种信号的复杂调控。RyR的突变体会导致诸如肌中央轴空病（central core disease, CCD）、恶性高热易感症（malignant hyperthermia susceptibility, MHS）等疾病。大量文献报道统计表明，目前已有超过500种RyR突变体与疾病有关。



RyR1单体结构域解析以及四聚体的三维电镜结构。

由于RyR的重要生理功能及其作为钙离子通道的基础研究意义，针对其结构与功能的研究一直备受关注。自上世纪70年代科学家发现这个蛋白、80年代开始系统研究RyR迄今近40年，国内外很多实验室都致力于对RyR的结构分析，但限于RyR庞大的分子量，蛋白获取和蛋白结晶的难度都十分大，之前仅有个别小片段的晶体结构。过去20年中，多篇文献报道了RyR的低分辨率电镜结构，揭示其蘑菇状的外形特征，但是这些电镜结构的分辨率最高只达到10埃（1纳米）左右，无法看清该蛋白的二级结构。

近两年单颗粒冷冻电镜在探测器和计算方法上发生革命性进展，利用冷冻三维重构的方法解析蛋白质原子分辨率结构已成为可能。颜宁研究组、施一公研究组与英国MRC的Sjors Scheres教授合作，摸索了新的蛋白纯化策略，获得优质的蛋白样品，利用单颗粒冷冻电镜方法，成功解析了兔源的RyR1蛋白与其抑制蛋白FKBP12的复合物三维结构。该结构总体分辨率达到了3.8Å，其中负责离子运输的跨膜区分辨率甚至超过3.5 Å，可以准确搭建原子结构模型。

兔源RyR1每个单体包含5037个氨基酸，其中3000多个氨基酸的原子坐标获得解析。除去之前已经获得的三个可溶区结构域片段，该电镜结构首次揭示了跨膜区（每个单体含有近500个氨基酸）、以及可溶区中三个全新结构域的接近原子分辨率三维结构。RyR1的结构整体呈现四次对称的金字塔形状。其跨膜区具有类似于电压门控离子通道的折叠特点，但还有额外的结构域以实现对通道开闭状态的调控。跨膜区的高分辨率及高质量密度揭示了RyR1识别钙离子的机理及其高通量运输钙离子的分子基础。整体结构分析显示了庞大的细胞质结构域的层级结构组织特征以及调控通道开关的可能机制。该研究对于肌肉-收缩偶联以及与之相关的疾病的认识也具有重要的意义，也为治疗相关疾病提供了重要的结构线索。



RyR1跨膜粒子通道区的三维结构模型。

本文的通讯作者是清华大学医学院的颜宁教授、生命学院的施一公教授以及英国MRC分子生物学实验室的Sjors H. W. Scheres教授；共同第一作者是清华大学医学院的四年级博士生闫浈，生命学院五年级博士生闫创业以及英国MRC的博士后白晓辰。清华大学生命学院的李雪明研究员和北京大学医学部生物物理学系尹长城教授参与该研究。

本研究受到科技部、基金委、生命科学联合中心-清华大学、生物膜与膜生物工程国家重点实验室的经费支持。颜宁是清华大学医学院拜耳讲席教授以及霍华德休斯医学研究院国际青年科学家。（清华大学）

http://www.nature.com/nature/jou ... ll/nature14063.html