广谱抗病毒药物 GS-5734 可抑制流行性冠状病毒 生化武

顾汉现

研究文章新兴感染
广谱抗病毒药物 GS-5734 可抑制流行性和人畜共患性冠状病毒
蒂莫西 P. Sheahan 1 , * ,艾米 C. 模拟人生1 , * ,雷切尔 L. 格雷厄姆1 ,Vineet D. Menachery 1，丽莎·E·格拉林斯基1 ,詹姆斯 B. 案例2，莎拉河莱斯特1，Krzysztof Pyrc 3 ,乔伊·冯4 ,伊娃·特兰切娃4 ,罗伊班尼斯特4 ,汝进公园4 ,大流士巴布西斯4 ,迈克尔·O·克拉克4 ,理查德 L. 麦克曼4 ,杰米·E·斯潘4，克里斯托弗·A·帕米奥蒂4，达斯汀西格尔4，阿德里安·S·雷4 ,托马斯·奇拉尔4，罗伯特乔丹4 ,马克河丹尼森5 , †和拉尔夫·S·巴里奇1 , †
1美国北卡罗来纳大学教堂山分校流行病学系，教堂山，NC 27599，美国。
2范德比尔特大学医学中心病理学、微生物学和免疫学系，美国田纳西州纳什维尔 37232。
3波兰克拉科夫雅盖隆大学生物化学、生物物理和生物技术学院微生物学系。
4 Gilead Sciences Inc.，福斯特城，CA 94404，美国。
5范德比尔特大学医学中心儿科和病理学、微生物学和免疫学系传染病科，美国田纳西州纳什维尔 37232。
↵ †通讯作者。电子邮件：mark.denison@vanderbilt.edu (MRD)；rbaric@email.unc.edu (RSB)
↵ *这些作者对这项工作做出了同等贡献。

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科学转化医学 2017 年 6 月 28 日：
卷。9，第 396 期，eaal3653
DOI：10.1126/scitranslmed.aal3653
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抗病毒药物在冠状病毒上取得了飞跃
与其他新出现的感染一样，冠状病毒可以从动物宿主传播到人群中，造成破坏性影响，例如 SARS 或 MERS 爆发。希汉等人。测试了一种小分子抑制剂，该抑制剂已显示出对埃博拉病毒的活性，可作为用于对抗冠状病毒的潜在药物。这种药物在细胞培养和 SARS 小鼠模型中对多种类型的冠状病毒有效，而且似乎没有毒性。鉴于其广泛的活性，这种抗病毒药物可以用于防止未来冠状病毒爆发的传播，而不管跳过的是哪种特定病毒。

抽象的
新出现的病毒感染难以控制，因为异质成员周期性地循环进出人类和人畜共患病宿主，使特定抗病毒疗法和疫苗的开发复杂化。冠状病毒 (CoV) 具有迅速传播到新宿主物种中并导致严重疾病的倾向。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 (SARS-CoV) 和中东呼吸系统综合症冠状病毒 (MERS-CoV) 相继出现，在全球范围内引起严重的流行性呼吸道疾病。能够抑制 CoV 感染的广谱疗法将解决当前未满足的医疗需求，并且在治疗新出现的和地方性 CoV 感染方面可能是无价的。我们展示了一种核苷酸前药 GS-5734，目前正在临床开发中用于治疗埃博拉病毒病，50 个值。GS-5734 还对原代人肺细胞中的蝙蝠 CoV、流行前蝙蝠 CoV 和循环的当代人类 CoV 有效，从而显示出广谱抗 CoV 活性。在 SARS-CoV 发病机制的小鼠模型中，GS-5734 的预防性和早期治疗性给药显着降低了肺病毒载量，改善了疾病的临床症状以及呼吸功能。这些数据提供了实质性证据，表明 GS-5734 可能证明对中东流行的 MERS-CoV、流行的人类 CoV 以及可能最重要的未来新兴 CoV 有效。

介绍
基因多样的冠状病毒 (CoV) 家族目前由四个基因组 [1 (alpha)、2 (beta)、3 (gamma) 和 4 (delta)] 组成，感染鸟类和各种哺乳动物。到目前为止，已知只有 CoV 组 1 和 2 会感染人类。尽管 CoV 复制机制表现出大量的校对活动，但病毒基因组 RNA 的复制本质上容易出错，从而推动了遗传相关但多样化的准物种的存在 ( 1 )。大多数 CoV 菌株的宿主范围很窄，但人畜共患病 CoV 具有跳入新宿主物种的倾向（2）。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 (SARS-CoV) 和中东呼吸系统综合症冠状病毒 (MERS-CoV) 是新出现的冠状病毒的最新例子，它们在免疫学幼稚人群中引起严重疾病。SARS-CoV 于 2002 年在中国广东出现，并在商业航空旅行的帮助下迅速传播到全球，造成 8000 多例病例，死亡率为 10% ( 2 )。2012 年，人们发现 MERS-CoV 进化为通过蝙蝠通过骆驼中间宿主感染人类，导致 1700 多例病例，死亡率接近 40%，与 SARS-CoV 一样，航空旅行已推动全球传播到 27 个国家( 2）。MERS-CoV 在中东流行，沙特阿拉伯王国和肯尼亚的血清学研究表明，人类感染相当频繁（>45,000 人）（3、4）。SARS-CoV 流行于十多年前结束，但已从蝙蝠中分离出几种类似 SARS 的 CoV，它们有效地利用人类血管紧张素转换酶 2 受体，在人类原代气道细胞中复制到高滴度，并且对现有的治疗药物具有抗性抗体和疫苗 ( 5 , 6 )。随着人类和野生动物生态系统重叠的增加，新型冠状病毒进入人类的潜力很大（2）。能够抑制已知人类 CoV 的广谱 CoV 疗法将解决当前未满足的医疗需求，并且在未来出现新的 CoV 时可能是一种宝贵的治疗方法。

目前，尚无批准的针对人类 CoV 的特定抗病毒疗法。尝试使用经批准的抗病毒药物（即利巴韦林和洛匹那韦-利托那韦）和免疫调节剂（即皮质类固醇、干扰素等）治疗 SARS-CoV 和 MERS-CoV 患者，但在随机对照试验中均无效 ( 7 ) . 有效的 CoV 特异性直接作用抗病毒药物 (DAA) 的临床开发一直难以捉摸，尽管有几种保守的可药用 CoV 酶靶标，包括 3C 样蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶和非结构蛋白 12 (nsp12) RNA 依赖性 RNA 聚合酶(RdRp) ( 7 )。2016 年，沃伦等人. 报道了腺苷类似物 GS-5734 的小分子单氨基磷酸酯前药在非人灵长类动物中对埃博拉病毒的体内抗病毒功效 ( 8 )。由于 GS-5734 对埃博拉病毒的作用机制是抑制病毒 RdRp，并且之前的工作表明 GS-5734 的核苷成分对 SARS-CoV 的活性较弱 ( 9 )，因此我们试图评估抗病毒效力和GS-5734 对多种人类和人畜共患病 CoV 的活性广度。

结果
GS-5734 阻止 SARS-CoV 和 MERS-CoV 在人气道上皮细胞中的复制
GS-5734 是一种前药，需要宿主细胞代谢为具有药理活性的三磷酸盐 (TP) 以抑制病毒复制 ( 9 )。为了确定 GS-5734 是否可以抑制高致病性人类 CoV 的复制，我们首先评估了连续人类肺上皮细胞系 Calu-3 2B4 (2B4) ( 10 ) 的抗病毒活性和细胞毒性。GS-5734 抑制 MERS-CoV 在 2B4 细胞中的复制，平均半数最大抑制浓度 (IC 50 ) 值为 0.025 μM（图 1A和图 S1）。我们在高达 10 μM 的浓度下没有观察到任何可测量的细胞毒性（图 1B和图 S1），因此证明 50% 的细胞毒性浓度（CC 50) GS-5734 在 2B4 细胞中超过 10 μM (CC 50 /IC 50 = 治疗指数，>400)。随着1 μM GS-5734的孵育，在48小时处理期间，2B4中GS-5734的药理活性TP的平均细胞内浓度为2.79 μM（图1C）。总之，这些结果表明，在肺中低微摩尔浓度的 TP 将实现对 CoV 复制的显着抑制。


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图。1。
GS-5734 在 2B4 细胞中的 MERS-CoV 抗病毒功效、毒性和代谢。
( A ) GS-5734 对 MERS-CoV 复制的平均抑制百分比。2B4 细胞在不同浓度的 GS-5734 存在下以 0.08 的感染复数 (MOI) 用 MERS-CoV 纳米荧光素酶 (nLUC) 一式三份感染 48 小时，然后通过 MERS-CoV 的定量测量复制-表示 nLUC。( B ) 2B4 细胞的细胞毒性与 (A) 类似。活力通过 CellTiter-Glo 测量。(A) 和 (B) 的数据代表三个独立实验。DMSO，二甲基亚砜。( C) 2B4 细胞中细胞内三磷酸核苷酸 (NTP) 的测量。在三个独立实验中，一式三份的细胞用 1 μM GS-5734 处理并随着时间的推移收获，以通过液相色谱-质谱 (LC-MS) 测量 NTP。

原代人气道上皮 (HAE) 细胞培养物是最具生物学相关性的肺体外模型之一，它概括了人类导气道的细胞复杂性和生理学 ( 11 )。我们评估了 GS-5734 在 HAE 培养物中对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的抗病毒活性。与未处理的对照相比，在 0.1 μM 时观察到接近 1 log 10的剂量依赖性复制减少，在 1 μM GS-5734 时超过 2 log 10 （图 2，A 和 B），平均 IC 500.069 μM (SARS-CoV) 和 0.074 μM (MERS-CoV) 的值。同时，我们通过定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 评估了细胞内基因组 [开放阅读框 1a (ORF1a)] 和亚基因组病毒 RNA [开放阅读框核衣壳 (ORFN)] 的丰度。对于 SARS-CoV 和 MERS-CoV，观察到 ORF1a 和 ORFN 的剂量依赖性降低（图 2、C 和 D，以及表 S1），与滴度降低一致。通过显微镜观察，MERS-CoV 感染的 HAE 细胞数量也随着 GS-5734 剂量的增加而减少（图 2E ））。为了评估 GS-5734 在 HAE 中的细胞毒性，我们首先测量了两种不同死亡受体 TNF（肿瘤坏死因子）和 FAS（Fas 细胞表面死亡受体）信号级联中多种促凋亡和抗凋亡因子的转录水平（图 1）。 S2、A 和 B，以及表 S2)。与均匀上调所有测量的细胞凋亡因子转录的阳性对照药物星形孢菌素不同，在抑制 CoV 复制的浓度下，我们没有观察到 GS-5734 处理的剂量依赖性效应。然后，我们通过 CellTiter-Glo 测定在用 10 或 0.1 μM GS-5734 或 DMSO 处理 48 小时的 HAE 中测量细胞毒性。正如所料，GS-5734 处理与 DMSO（CC 50在 HAE > 10 μM 中；治疗指数，>100；无花果。S2C)。为了评估 GS-5734 在另一种原代人肺细胞类型中的细胞毒性，我们将正常人细支气管上皮 (NHBE) 细胞培养物暴露于 GS-5734 或两种已知的细胞毒性化合物嘌呤霉素或星形孢菌素的稀释液中（图 S3）。在 NHBE 中，GS-5734 的平均 CC 50确定为 45 μM，比在 2B4 细胞中观察到的 MERS-CoV 的 IC 50 值 (0.025 μM) 高1800倍，比观察到的 IC 50值高 600 倍HAE 细胞中的 MERS-CoV（0.074 μM）（图 S3、A 和 B）。总之，我们证明了 HAE 对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的抗病毒功效，其浓度至少比具有可观察到细胞毒性的浓度低 100 倍。


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图 2。
GS-5734 可防止 HAE 细胞中的 SARS-CoV 和 MERS-CoV 复制。
( A ) GS-5734 在原代 HAE 细胞培养物中对 MERS-CoV 的抗病毒功效。HAE 细胞用 MERS-CoV 红色荧光蛋白 (RFP) 在 GS-5734 存在下以 0.5 的 MOI 一式两份感染 48 小时，然后收集顶端清洗液用于病毒滴定。显示了来自三个不同细胞供体的两个独立实验的代表性数据。PFU，斑块形成单位。( B ) GS-5734 在 HAE 细胞中对 SARS-CoV 的抗病毒功效。用 SARS-CoV 绿色荧光蛋白 (GFP) 感染培养物，如 (A) 中所述进行处理和分析。( C ) MERS-CoV ORF1 和 ORFN mRNA 的 qRT-PCR。从 (A) 中的培养物中分离总 RNA 用于 qRT-PCR 分析。( D) 来自 (C) 的细胞中 SARS-CoV ORF1 和 ORFN 的 qRT-PCR，如 (B) 中所述。( E ) HAE 细胞用 MERS-CoV RFP 感染并用 GS-5734 处理，如 (A) 所示。在荧光成像之前，用 Hoechst 33258 对细胞核进行染色。

GS-5734 对 HAE 中的多种人类和人畜共患 CoV 有效
CoV 宿主特异性和进入宿主细胞是由病毒刺突糖蛋白引导的，其广泛的遗传变异反映了宿主物种的多样性和病毒受体使用的变化（图 3A）。相反，CoV RdRp nsp12 在 CoV 之间高度保守，尤其是在基因组内（图 3A），使其成为潜在的广泛适用的药物靶点。


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图 3。
GS-5734 对 HAE 中的多种人类和人畜共患 CoV 有效。
( A ) 由所有四个 CoV 基因组的代表创建的邻接树，显示 CoV nsp12 (RdRp) 和 CoV 刺突糖蛋白的遗传相似性，后者介导宿主向性和进入细胞。病毒株标签的文字颜色对应于左侧的病毒宿主种类。与每个相邻树相邻的热图描绘了针对 SARS-CoV 或 MERS-CoV 的氨基酸同一性百分比（% AA 同一性）。（乙) 上图：GS-5734 在 HAE 细胞中对循环第 1 组人类 CoV (HCoV-NL63) 和来自第 2b 组（HKU3、SHC014 和 WIV1）和 2c (HKU5) 的蝙蝠冠状病毒的抗病毒功效。HAE 细胞在 GS-5734 存在下以 0.5 的 MOI 感染一式两份。48小时后，通过噬斑测定滴定产生的病毒。每个数据点代表每种文化的滴度。底部：来自顶部培养物的总 RNA 中 CoV ORF1 和 ORFN mRNA 的 qRT-PCR。

因为我们观察到对基因组 2 的两个成员（SARS-CoV 和 MERS-CoV）具有抗病毒作用，所以我们试图评估 HAE 细胞中对人类和人畜共患蝙蝠 CoV 的遗传多样性阵列的抗病毒活性的广度。用感染人类 CoV NL63 的 GS-5734 处理 HAE 培养物，人类 CoV NL63 是一种循环的第 1 组人类 CoV，通常会导致支气管炎 ( 12 )，导致0.1 μM 的病毒产量显着减少3 log 10 ，在较高浓度下无法检测到病毒（图. 3B）。同样，GS-5734 治疗抑制了非常多样化的 SARS-CoV 样组 2b（HKU3、WIV1 和 SHC014）和 MERS-CoV 样组 2c（HKU5）蝙蝠 CoV 的复制。其中，WIV1 和 SHC014 作为“流行前毒株”特别受关注，它们可以在没有适应的情况下感染 HAE 培养物，因此准备在人类中出现 ( 5 , 6 )。使用 1 μM GS-5734，蝙蝠 CoV 的传染性病毒产量减少 1.5 log 10至 2 log 10，病毒基因组和亚基因组转录本水平减少 1 log 10至 2 log 10（图 3B ））。总之，这些数据表明 GS-5734 可以抑制广泛多样的 CoV，包括循环人类 CoV、人畜共患病蝙蝠 CoV 和大流行前人畜共患病 CoV。

使用 GS-5734 进行预防性治疗可减少 SARS-CoV 疾病
GS-5734 在小鼠中的血浆稳定性相对较差（即，半衰期，<5 分钟），这是由于人体内不存在分泌的羧酸酯酶 1c ( Ces1c ) 的表达 ( 13 )。在基因缺失Ces1c ( Ces1c -/- )的小鼠中，GS-5734 的血浆稳定性显着增加（半衰期，约 25 分钟；图 S4 ）。我们通过感染两种菌株的年龄和性别匹配的小鼠证实，通过体重减轻和肺病毒滴度测量的 SARS-CoV 发病机制在野生型 (WT) C57BL/6J 和Ces1c -/-小鼠中相似（图.S4)。然后我们评估了Ces1c中的药代动力学 (PK) 曲线-/-小鼠皮下给药 50 mg/kg 每天一次 (QD) 或 25 mg/kg 每天两次 (BID)。前药的血浆浓度迅速降低，伴随着短暂暴露于丙氨酸代谢物（Ala-Met）和更持久地暴露于核苷类似物（图4A）。酯酶缺陷小鼠的血浆 PK 曲线与之前报道的猴子相似（8)，但代谢物的组织积累在小鼠中的效率降低了约 10 倍，这表明高剂量和相应的血浆暴露对于获得与人类预测的肺 TP 水平相似是必要的。肺中的代谢物谱显示 TP 是主要的细胞内代谢物，建立了对总肺代谢物水平的技术挑战较小的评估，作为 TP 的近似值（图 4B ））。尽管 50 mg/kg QD 和 25 mg/kg BID 均导致目标最大肺水平，但组织活化不仅在小鼠中效率较低，而且 TP 在小鼠肺中的半衰期（约 3 小时）相对较短与在体外人肺细胞或体内非人灵长类动物肺中观察到的结果相比（半衰期，~20 小时；图 S5）。因此，只有 BID 给药方案能够将肺水平维持在 12 到 24 小时之间，这与人类预期的水平一致，并且足以在给药间隔内维持 CoV 抑制（图 4C）。

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图 4。
GS-5734 在Ces1c -/-小鼠中的药代动力学。
( A ) GS-5734 (25 mg/kg) 皮下给药后Ces1c -/-小鼠血浆中的药代动力学。采集纵向血浆样本以通过 LC-MS 测量前药 GS-5734、中间代谢物 Ala-Met 和核苷。( B ) GS-5734 (50 mg/kg) 皮下给药 4 小时后Ces1c -/-小鼠肺中的肺 TP 。显示单磷酸 (Nuc-MP)、二磷酸 (Nuc-DP)、三磷酸 (Nuc-TP) 和总核苷酸（Nuc-MP、Nuc-DP 和 Nuc-TP 的总和）。( C ) GS-5734 以 25 mg/kg BID 或 50 mg/kg QD 皮下给药后Ces1c -/-小鼠肺中总核苷酸的药代动力学。

SARS-CoV 疾病的小鼠模型忠实地概括了人类 SARS-CoV 发病机制的许多方面，包括厌食、肺中病毒的高滴度复制、急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 的发展以及与年龄相关的疾病（14）。如图5A 所示，以 50 mg/kg QD 或 25 mg/kg BID 的预防性给药改善了载体治疗所见的 SARS-CoV 诱导的体重减轻。与载体处理的动物相比，GS-5734 处理的小鼠在感染后 2 天和 5 天 (dpi)肺中的病毒滴度显着降低 ( P < 0.05) (图 5B )。此外，GS-5734 处理的动物肺切片中病毒抗原染色水平显着降低。P < 0.05) 与载体处理的动物相比（图 5，C 和 D)。与载体治疗的动物相比，用 GS-5734 治疗还减少了 SARS-CoV 诱导的肺部病理学，包括剥脱性细支气管炎、炎症浸润的血管周围积聚（即“袖带”）和与弥漫性肺泡损伤相关的肺泡内水肿（图 5E和图 S6）。


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图 5。
用 GS-5734 进行预防性治疗可减少 SARS-CoV 疾病。
( A ) 用载体 ( n = 42) 或 GS​​-5734 [25 mg/kg BID ( n = 25)从 -1 dpi 开始感染 10 4 PFU SARS-CoV MA15的Ces1c -/-小鼠的起始体重百分比或 50 mg/kg QD ( n = 28)]。( B ) (A) 中小鼠的 SARS-CoV 肺滴度在 2 dpi（车辆，n = 11；50 mg/kg，n = 11；25 mg/kg，n = 5）（左）或 5 dpi（车辆，n = 13；50 mg/kg，n = 13；25 mg/kg，n = 4)（右）。ns，不显着。( C) 小鼠肺切片中 SARS-CoV 抗原的定量分析 (A)，2 dpi（左）（载体，n = 15；50 mg/kg，n = 12；25 mg/kg，n = 7）（左）或 5 dpi（车辆，n = 10；50 mg/kg，n = 12；25 mg/kg，n = 4）（右）。( D ) 2 和 5 dpi 肺切片中 SARS-CoV 抗原染色（棕色）和细胞核（蓝色）的显微照片。( E ) 苏木精和伊红染色的小鼠肺切片 2 dpi 的显微照片，突出了导气道管腔 (aw)。（F）WBP用于测量（A）中小鼠的肺功能。Penh 是支气管收缩的替代指标。过期时间（te ) 是释放一次呼吸所需的时间。呼气暂停结束 (EEP) 是两次呼吸之间的时间。(A)、(B)、(D) 和 (I) 的符号和误差线代表平均值和 SD。方框包含第 25 到第 75 个百分位，而胡须代表 (C)、(E) 和 (F) 中的范围。通过对 (D)、(F) 和 (I) 进行 Tukey 多重比较检验以及对 (E) 进行 Kruskal-Wallis 检验的双向方差分析 (ANOVA)，星号表示统计显着性 ( P < 0.05)。

用 GS-5734 进行预防性治疗可防止在 SARS-CoV 感染、载体治疗的动物中看到的肺功能缺陷，这是通过全身体积描记法 (WBP) 测量的，这是一种非常敏感的肺功能定量方法 ( 15 )。与用 GS-5734 处理的动物相比，载体处理的动物中的 Penh 是气道阻力或碎片积累的替代测量值（图 5F ）显着升高（ P < 0.05 ）。与给予 GS-5734 的动物相比，载体治疗动物的呼吸困难指标，例如呼气时间增加和一次呼吸结束与下一次呼吸开始之间的暂停时间延长（图 5F）。

GS-5734的治疗性暴露后给药可减轻疾病
由于 GS-5734 的预防性给药可降低病毒肺滴度、改善肺功能并改善 SARS-CoV 疾病的症状，因此确定治疗性治疗是否也有效是有意义的。首先，我们比较了从 -1 dpi（即预防性）或 +1 dpi（即治疗性）开始的 GS-5734（25 mg/kg，BID）的抗病毒功效。治疗性 GS-5734 显着降低了 SARS-CoV 引起的受感染动物体重减轻（图 6，A 和 B）并显着抑制病毒肺滴度（P = 0.0059），从而证明 GS-5734 的治疗性给药可以减少疾病并在持续感染期间抑制复制（图 6C）。治疗性治疗显着（P= 0.003) 与载体处理的对照相比，肺功能得到改善（即 Penh 评分降低）（图 6D）。然后，我们探索了 GS-5734 在 2 dpi 时的治疗潜力，这是在病毒复制和肺气道上皮损伤达到顶峰之后（图 S7）。疾病严重程度和生存率没有因治疗而异，但我们观察到显着降低（P< 0.05) 在 6 dpi 时 GS-5734 处理的动物的 SARS-CoV 肺滴度。这些数据表明，达到肺滴度峰值后病毒载量的降低不足以改善疾病的免疫病理学阶段开始后的结果。因此，在小鼠中，如果在 SARS-CoV 复制高峰和气道上皮损伤高峰之前给予，GS-5734 可以改善肺功能、减少病毒载量并减少疾病。


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图 6。
GS-5734 的治疗性暴露后给药可减轻疾病。
( A )感染 10 3 PFU SARS-CoV MA15 并用载体或 GS-5734 (25 mg/kg) 处理 BID的 27 至 28 周龄雌性Ces1c -/-小鼠的起始体重百分比，从 -1 开始dpi（车辆，n = 5；GS-5734，n = 10）或 +1 dpi（车辆，n = 4；GS-5734，n = 11）。通过双向 ANOVA 和 Tukey 的多重比较测试，GS-5734 治疗的动物的体重在 3 和 4 dpi 的预防组和 4 dpi 的治疗组与载体治疗的动物的体重有统计学差异 ( P < 0.05)。( B ) (A) 中 4 dpi 时小鼠的起始体重百分比。( C) 如 (A) 中所述感染和治疗的小鼠中的 SARS-CoV 肺滴度。星号表示(B) 和 (C) 的 Mann-Whitney 检验具有统计学意义 ( P < 0.05)。( D ) WBP 用于测量感染和治疗的小鼠的肺功能，如 (A) 所述。Penh 是支气管收缩或气道阻塞的替代指标。星号表示采用 Šidák 多重比较检验的双向 ANOVA 的统计显着性。
讨论
新出现的病毒感染代表了一个关键的全球健康问题，因为通常缺乏特定的抗病毒疗法和疫苗。为了最大限度地发挥针对新兴病毒的疗法的潜在公共健康益处，它们应该对过去（即 SARS-CoV）、当前（即 MERS-CoV）和未来新出现的病毒威胁有效。了解治疗效果的范围对于做出明智的临床决策至关重要，尤其是在暴发的早期阶段。由于人畜共患病 CoV 的出现是由人类、野生动物和病毒因素的混合驱动的，因此很难仅根据病毒基因组序列来衡量人畜共患病 CoV 出现的潜力（2）。在这里，我们提供了一个成功的公私合作的例子，它结合了宏基因组学、合成生物学、原代人类细胞培养模型、药物代谢、PK 和病毒发病机制的体内模型，以证明候选药物对病毒家族容易出现（图S8）。尽管我们证明了对来自多个 CoV 基因组的人类和人畜共患 CoV 的广谱功效，但我们尚未评估所有 CoV 基因组的抗病毒功效，这是我们目前研究的一个限制。尽管如此，我们重建的人类和人畜共患病蝙蝠 CoV 小组对于确定 GS-5734 是否对高度分化的新兴（SARS-CoV）、新兴（MERS-CoV）和具有大流行潜力的循环人畜共患病株（即， WIV1 和 SHC014) (5、6、16、17 )。 _ _ _ _ _ 未来，新兴病毒的疫苗、疗法和诊断方法的快速发展将取决于这些病毒在实验室中的重建和体外和体内适应。

在这里，我们报告了一种小分子在体外和体内对多种基因不同的 CoV 的广谱抗病毒功效。目前的疫苗和人单克隆抗体方法已被证明是有效的，但由于 CoV 刺突糖蛋白中的抗原多样性，保护范围通常有限 ( 5 , 6）。相反，由于 CoV 复制酶的固有遗传保守性，GS-5734 等 RdRp 靶向疗法更可能对过去、现在和未来的 CoV 具有广泛的活性。正如核苷前药巴拉匹韦未能将体外疗效转化为小鼠和人类体内疗效所证明的那样，抗病毒候选药物应在最具生物学相关性的发病机制模型中进行彻底评估，以最大限度地提高临床可转化性 ( 18 )。核苷类似物主动转运和/或代谢的细胞类型特异性差异可能会影响抗病毒谱 ( 19 )。因此，我们的目标是扩展之前对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 抗病毒功效的体外研究，这些研究仅限于猴肾癌细胞系（8, 9 )。HAE 细胞培养物的细胞复杂性和生理学与人类导气道相似，含有粘液分泌细胞、基底外侧细胞以及 SARS-CoV（纤毛上皮细胞）和 MERS-CoV（非纤毛上皮细胞）的一些主要靶细胞体内 ( 11 , 20 )。凭借我们的 HAE 细胞抗病毒功效数据，我们提供了强有力的证据表明 GS-5734 将在人肺中多种人类和人畜共患 CoV 靶向的细胞中被吸收和代谢。

临床前体内抗病毒功效研究提供了对药物的 PK/药效学 (PD) 关系的深入了解，从中可以推断出有效的给药方案用于人体临床试验。为了最大限度地发挥临床前 PK/PD 研究的效用，使用能够准确概括人类疾病的动物模型至关重要。本文使用的适应小鼠的 SARS-CoV (SARS-CoV MA15) 模型捕获了人类疾病的多个方面，包括仅限于肺部的高滴度病毒复制、ARDS 的发展、与年龄相关的疾病恶化，以及死亡。与感染 SARS-CoV 的人类在症状出现后 7 到 10 天病毒滴度达到峰值相比，感染 SARS-CoV MA15 的 C57BL/6 小鼠肺部的病毒滴度迅速增加 4 到 5 个对数，并在 2 dpi 达到峰值,14 )。2 dpi 后，病毒滴度减弱，病程的其余部分由免疫病理学驱动。因此，人类复制高峰前的 7 到 10 天被压缩到我们小鼠模型的前 48 小时。与人类相似，感染 SARS-CoV 的小鼠的疾病严重程度与肺病毒载量直接相关，这可以通过增加输入病毒的剂量来调节 ( 14 , 21）。通过 GS-5734 的预防性 (-1 dpi) 和治疗性 (+1 dpi) 给药，我们证明复制减少到低于致病阈值。从 2 dpi 开始的治疗性治疗降低了肺病毒载量，但并未改善疾病结果，这表明在病毒复制和免疫病理学达到临界点后开始的抗病毒药物在临床上没有益处。考虑到流感抗病毒药物奥司他韦开创的先例，这一结果并不令人惊讶，在出现症状后，治疗效果会随着时间的推移而降低 ( 22 )。与 SARS-CoV 一样，MERS-CoV 在呼吸道中的滴度在出现症状后的第二周达到峰值（23）。因此，与实验感染的小鼠相比，在出现症状后但在达到峰值病毒滴度之前进行抗病毒治疗的窗口应该在人类中延长。不幸的是，上述小鼠和人类在 SARS-CoV 发病机制上的差异限制了我们确定治疗不再对人类提供临床益处的时间的能力。尽管如此，我们的研究提供的数据强烈支持在非人类灵长类动物中测试 GS-5734，并表明如果在感染过程中及早给予，用 GS-5734 治疗 MERS-CoV 感染的人类将有助于减少病毒复制和疾病.

目前，没有针对 SARS-CoV 或 MERS-CoV 专门针对该病毒的批准抗病毒治疗。目前正在开发针对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的多种治疗方法，包括免疫调节、疫苗接种、DAA 和宿主靶向抗病毒药物 ( 7 )。已知的抗病毒药物，如利巴韦林和洛匹那韦-利托那韦，以及免疫调节剂，如干扰素和皮质类固醇，已被用于治疗 SARS-CoV 和 MERS-CoV 患者，但在随机对照试验中均未证明有效 ( 7）。多个细胞系的细胞培养研究已经证明了几种美国食品和药物管理局批准的药物（利托那韦、洛匹那韦、奈非那韦、霉酚酸和利巴韦林）的抗病毒作用，但相互矛盾的结果和实验不一致使解释变得困难 ( 24 – 29 ) . 针对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的小分子已在体外癌细胞系中进行了评估，但它们对其他人类或人畜共患 CoV 的抗病毒功效仍然未知 ( 16 , 30 )。在 CoV 病毒发病机制的动物模型中评估的小分子很少，有些甚至被证明会加剧疾病（例如利巴韦林和霉酚酸）（31、32）。尽管本文使用的Ces1c -/-小鼠提高了药物稳定性，但它们不适合 MERS-CoV 功效研究，因为 MERS-CoV 受体的鼠直向同源物二肽基肽酶 4 (DPP4) 不会促进 MERS-CoV 感染。33 ). 因此，我们的体内研究仅限于 SARS-CoV，未来的研究将评估 MERS-CoV 在双转基因人源化 DPP4/ Ces1c -/-小鼠中的功效。GS-5734 的人体安全性测试正在进行中，该药物已根据“同情使用”条款用于治疗少数埃博拉病毒感染患者（34）。总体而言，我们的工作提供了证据，表明 GS-5734 可以保护 CoV 感染的患者免于进展为严重疾病，并且可以预防性地保护现有 MERS-CoV 流行地区的卫生保健工作者，并且当新型 CoV 出现时，其广谱活性可能被证明是有价值的未来出现。

更多：

https://web.archive.org/web/2018 ... 9/396/eaal3653.full

瑞德西韦：

https://zh.wikipedia.org/wiki/%E ... 7%E8%A5%BF%E9%9F%A6



OK:/ 终于知道什么叫了！%水下拍摄 %水下摄影 %视觉震撼 %大自然   https://v.douyin.com/8qxKhRm/ 椱制此链接，打开Dou音搜索，直接观看视频！



丑闻爆出！美国西点军校被爆泄露新冠病毒是美国生化武器  （抖音）

https://www.douyin.com/search/%E ... ch&type=general

https://www.douyin.com/video/699 ... C5hUsH6hHUcVlgy3tCY

美国西点军校文件泄露：蓬佩奥演讲称新冠病毒是美国生化武器  （文章）

http://www.kunlunce.com/ssjj/fl11/2021-08-08/154160.html

新华网 > 国际 > 正文
2021
05/30
16:12:05
来源：澎湃新闻
美国德堡生物实验室暗史：埃博拉病毒泄露惊魂
http://www.xinhuanet.com/world/2021-05/30/c_1211178777.htm



新冠病毒疫情
专访前美国防部高官：德堡阴谋论“没有丝毫证据”
2021年8月21日 22:50
叶凡
https://www.voachinese.com/a/VOA ... erview/6010976.html

中国反美舆论战假新闻满天飞 目的何在？
2021.08.11 15:56 ET
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https://www.rfa.org/mandarin/yat ... 08112021102000.html

顾汉现

环球聚焦 > 新冠疫情 > 阅读信息

美国西点军校文件泄露：蓬佩奥演讲称新冠病毒是美国生化武器

点击：53078  作者：综合    来源：昆仑策网

【综合】  发布时间:2021-08-08 10:07:04


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【编者按】以下五页是网传从美国西点军校泄露出来的秘密文件：2020年6月13日时任美国国务卿蓬佩奥的在线演讲《给军官学员们的建议书》。粗略翻译的内容，看完后让人毛骨悚然，对新冠病毒来源恍然大悟，原来新冠病毒完全是美国蓄意制造的生化战基因战武器！只可惜，利令智昏的蓬佩奥内部演讲道破天机早了点，新冠病毒疫情并没有按照他想象的方向发展，贼喊捉贼的病毒溯源阴谋也藏不住了，必然暴露于光天化日之下！


标题和公开演讲部分

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【第1页：“题目”；第2页：“公开演讲部分”】



译文：

给军官学员们的建议书
主题：国务卿迈克尔·理查德·蓬佩奥在线演讲的手稿

2020年6月13日   西点军校

第一部分：公开演讲

2020级西点的同学们你们好，
  
我是美国国务卿迈克尔.蓬佩奥，我34年前从这个神奇的学院毕业加入了陆军委员会。我在西点军校的日子教会了我自律、追求卓越和对服务公众的崇高追求。它还教会了我友爱，团结同学，他们会是陪你同甘共苦的最亲密的朋友。从现在起你们将永远是西点军魂的一部分。珍惜作为初级军官的时光吧，带着你的小分队完成祖国给你的任务。我期盼你们完成任务，怀着对这三个神圣的词的尊重：责任、荣誉和国家。

我理解你们的座右铭有我们所指引的远见卓识，你们所印的雄鹰在提醒你们这一点。我敦促你们能坚守这愿景并思考一下当你走向世界该如何保护美国以及我们这个时代的价值观。此时此刻，我们正在与一些像中国一样的***政府竞争，他们和我们的价值观不同。我们需要你们的远见，你们的引领，来帮助我们的人民过着平静安稳的生活，确保我们的国旗能够永远自由飘扬。
  
疫情让过去的几个月对于所有人都很难熬。毋庸置疑你们在以后的职业生涯中将会遇到其他挑战，它们会迫使你解决棘手的问题，迫使你富有创造性，迫使你去成功。我完全有信心你们能做到。今天只是终生回馈这个特别的国家的开始，你们已经做好了最充分的准备，你们将接替我们，你们将塑造这个国家的命运！
  
祝贺你们！祝贺你们！
  
作为西点军校的毕业生，我以你们为荣！永远不要忘记“beat navy！（西点军校拉拉队的口号）”

秘密演讲部分



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【第3-5页“秘密演讲部分”】



第二部分：内部演讲

各位长官：

再次祝贺你们！现在，演讲要保密了。我来这里之前特朗普总统专门叮嘱我：“别吓着那些孩子们！”但我认为我不得不把话说清楚，这样我们才能完美的完成我们的战争。

事实上，人类历史一直就是和各类战争纠缠在一起的。对苏联，真正的战争不是群体作战，我们用经济战给了他们一个残酷的教训；对伊拉克，真枪实弹才是真正的战争；然后我们投掷了一枚原子弹来摧毁了萨达姆.侯赛因。中国有一个智慧的名言是这样的说的：不战而屈人之兵，善之善者也”。意思是如果我们不用流血，不用牺牲无数的士兵就能赢得战争，为什么不这么做呢？
  
因此，我之前就说服特朗普总统即使中国袭击台湾，我们也避免军事干预，这会带来重大损失。我们的航空母舰可能会沉没，我们在日本和韩国的军事基地可能会被中国打击，这会引发世界核战，从而终结人类摧毁整个地球。即使我们一流的反导弹系统能够把中国夷为平地，数据表明，我们袭击之后留在中国的核力也将足以使地球倒退数百万年。
  
这意味着在这个星球上不能在爆发一战或者二战那样的战争了，我们必须选择一个更机智的办法来摧毁我们潜在的敌人，包括中国，俄国，伊朗以及其他国家，并且确保我们的人民不受伤。

长官们，现在你们可能明白了，特朗普总统所说的秘密武器绝不是一枚小型炸弹而是目前世界流行的新冠病毒！互联网上某些广为流传的理论是真的。国防部把这列为顶级机密，GOF的最终目标是开发生化武器，并且只有那些签约参与研究和开发的大学和科学家是被隐瞒的。

你们必须认识到这个生化武器的研究和开发远比制造一个F-35战斗机要复杂的多。首先，我们必须基于不同的种族的DNA来预设用于袭击的病毒的基本特征以及设置是否这个病毒袭击的后果会像埃博拉病毒那样导致迅速死亡或者广泛传播以及像艾滋病那样遗传给下一代。我们更喜欢快速死亡，因为这看起来更实用。然而，病毒学家认为迅速死亡会削弱病毒的传播。国防部做了一些折中，这样就既可以促进病毒传播，又可以通过降低迅速死亡率来增加伤亡人数。
  
为了使所有部分都符合联邦法律，国防部把这项工作分解了。许多公司和研究所共同承担这项工作的不同部分。有些负责收集天然病毒样本；有些负责设备的研发；有些负责修改基因；有些负责研究种族差异；有些负责哨兵实验室的测试；有些负责药物研发；有些负责处理负面新闻，这意味着整个工作是机密的。即使有人能把它们联想到一起，他们会被当成疯子，不会揭露我们的真正计划。

实际上，20世纪的SARS病毒就是生化武器，前些日子流行的SARSⅡ也是。有些傻科学家起初并不知道他们手中病毒样本的危害以及传播途径，不专业的防护措施导致了病毒的泄露。早在2014年政府责任署就这个问题曾发出警告，但是并没有健全的程序来约束科学家的行为。你们知道这个问题多严重吗？据CIA掌握，自2010年以来侦查到的泄露就超过50起，包括病毒，细菌以及辐射。
  

尽管新冠病毒的泄露是个意外，结果却帮了我们国家一个大忙。当初研究新冠病毒预设的目标人群就是印度、中国、日本以及意大利人，他们肺部的ACE2蛋白很高，因此他们很容易被感染。白种人和美国黑人体内的ACE2蛋白相对要低，因此在新冠病毒面前他们相当安全。对于我这种意大利裔美国人，我们可以通过接种疫苗来对SARS2免疫。
  
从两方面来说，发动这次战争的最终目标是获取资源。

首先，资源是有限的，不应该被底层阶级浪费，他们的人口迅速增长，生活水平的提高会导致环境的恶化，对我们的进步造成消极影响。从历史角度来说，战争是减少人口的最佳途径，如果没有一战和二战，地球人口早就爆炸了。所以，我们可以看出新冠病毒的泄露其实是个伟大的成功，它杀死了第三世界成千上万的人口，还会继续杀死更多，使我们居住的世界更美好。

另外，我们要从我们的对手和敌人那里剥夺资源，包括财富和自然资源。人们为了治疗SARS2或者预防它，不得不购买瑞德西韦。所有的制造商都是国防部的供应商，这意味着全球都在给我们国家送钱。在我看来，这是比暴力抢夺、战争赔偿或者武器销售更明智的获取资源的方式。

因此，这次泄露使我们的生活更美好也使美国再次伟大了！先生们，你们的使命随着高科技的进步已经发生了改变。你们要理解，当你们被部署到世界不同角落的时候，你们将面临的是没有硝烟的战争。维护世界秩序、确保美国优先是你们的使命！
  
现在，第三次世界战争已经打响，更多的泄露还将继续！

冲吧，去掠夺世界吧，我的孩子们，上帝保佑你们！上帝保佑美利坚！

迈克尔·理查德·蓬佩奥
美国国务卿




【信息来源】Belen：

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（来源：昆仑策网【综合】，修订发布，资料源自“种花家的菌事兔”等）


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