Nat C:原子水平下解析诱发朊病毒病关键蛋白特殊结构 碳氢

邓文龙

Nat Commun：重磅！科学家在原子水平下成功解析诱发朊病毒病关键蛋白的特殊结构

由一系列碳原子和氢原子位置上发生的一些看似微不足道的差异所引起的  碳氢

2017-11-09 21:21

2017年11月9日 讯 /生物谷BIOON/ --最近，一项刊登在国际杂志Nature Communications上的研究报告中，来自俄亥俄州立大学(The Ohio State University)的研究人员对一种能诱发人类出现遗传退行性大脑疾病的特殊蛋白进行了研究，结果发现，人类、小鼠及仓鼠机体中拥有几乎完全相同氨基酸序列的蛋白质实际上在原子水平下会表现出不同的三维结构。

图片来源：Theint Theint et al.

这种蛋白质会引发家族性脑淀粉样血管病（CAA），而这项研究中研究人员首次在三种不同物种中检测了这种特殊蛋白的结构。研究者Christopher Jaroniec表示，这项研究强调了一个事实，即单一氨基酸的微小改变会诱发蛋白家族中不同蛋白的结构和功能之间出现深远的差异。这些蛋白质的结构和传递特性会出现一些大规模的差异，而这似乎是由一系列碳原子和氢原子位置上发生的一些看似微不足道的差异所引起的。

这项研究并未形成治疗或检测CAA的新方法，而研究人员利用这些蛋白质作为模型来研究为何在不同物种之间会发生朊病毒病的传播，文章中，研究者利用固体核磁共振光谱技术（NMR）对和朊病毒病相关的蛋白质的结构进行了成像及分析。研究者表示，在机体中，和CAA相关蛋白质分子会在大脑的血管壁中形成斑块，但研究人员却并未详细阐明这些斑块的分子结构，2008年，研究人员通力合作对相关的朊病毒蛋白突变体进行了初期的固态研究，最后将发挥功能的可能关键氨基酸数量缩小到了大约30个。

如今，研究者发现，编码为139号的单一氨基酸或许就是关键，其能够帮助朊病毒蛋白突变体采用“人类样”的结构而不是“仓鼠样”结构；而另外一种编号为122的氨基酸则会指导人类和小鼠机体中相同版本的蛋白质之间出现结构性的差异，同时研究者还发现，这两种氨基酸似乎还会引发相同蛋白质序列内部出现结构特殊的“朊病毒株”序列。

我们所熟知的朊病毒病包括牛海绵状脑病（疯牛病）和人类克雅氏病等疾病，这些疾病都非常难以治疗，而且致死率极高，有些疾病甚至可以传播；研究者指出，斑块内大脑朊病毒蛋白所采用的特殊结构被认为对于不同宿主之间疾病传播以及引发疾病非常重要。最后研究者Jaroniec表示，目前我们的研究人员正在进行深入研究来解析和家族性CAA相关的朊病毒蛋白突变体的高分辨率分子结构，目的就是对疾病传播背后的因素进行深入完全的理解，而当前研究向这这一目标又迈进了一步。研究人员希望未来其他科学家们或许也能利用类似的方法学来揭示朊病毒疾病传播的结构基础和新型分子机制。（生物谷Bioon.com）

原始出处：

Theint Theint, Philippe S. Nadaud, Darryl Aucoin, et al. Species-dependent structural polymorphism of Y145Stop prion protein amyloid revealed by solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications 8, Article number: 753 (2017) doi:10.1038/s41467-017-00794-z

https://www.nature.com/articles/s41467-017-00794-z

http://news.bioon.com/article/6712787.html



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邓文龙

软件译:

文章

Y145Stop朊病毒蛋白淀粉状蛋白的物种依赖性结构多态性通过固态NMR光谱显示

Theint Theint，Philippe S. Nadaud，Darryl Aucoin，Jonathan J. Helmus，Simon P. Pondaven，Krystyna Surewicz，Witold K. Surewicz＆克里斯托弗P. Jaroniec
Nature Communications  8，商品编号：  753（2017）
doi：10.1038 / s41467-017-00794-z

朊病毒蛋白质聚集固态NMR
收稿日期：
2016年12月23日
公认：
2017年7月28日
在线发布：
2017年9月29日
抽象
朊病毒疾病最令人费解的方面之一是朊病毒毒株与种间传递障碍之间复杂的关系。以前我们已经表明哺乳动物朊病毒繁殖的某些基本方面，包括菌株现象和物种障碍，可以在Y145Stop朊蛋白变体的接种原纤维化中体外复制。在这里，我们使用固态核磁共振光谱学来获得三个物种的Y145Stop朊蛋白淀粉样蛋白结构差异的原子级水平：人类，老鼠和叙利亚仓鼠。值得注意的是，我们发现这些结构差异在很大程度上受112和139位两个氨基酸的控制，并且相同的残基似乎是同一蛋白质序列内出现结构不同的淀粉样蛋白菌株的关键。这些残基作为构象转换的作用可以基于人类Y145Stop朊病毒蛋白淀粉样蛋白的模型来合理化，为了解跨种子特异性提供基础。

介绍
朊病毒疾病是影响人和以及许多动物物种传染性神经退行性疾病的一个不同的小组1，2，3，4。所有这些疾病都与朊病毒蛋白（PrP）（一种尚未知的生理功能的膜相关糖蛋白）的错误折叠和聚集有关。朊病毒（表示的PrP的正常，单体形式的自传播转换Ç）到聚合物，富含β片材构象异构体（PRP 钪）被认为是在朊病毒疾病的发病机理的关键分子事件1，2，3，4。此外，丰富的实验数据的支持“蛋白仅”的模式，这意味着的PrP 钪本身是感染性朊病毒剂1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。

之一的朊病毒病的最有趣的，并且仍然知之甚少方面是多发性朊病毒毒株引起不同的疾病表型相同的哺乳动物物种中的存在1，2，3。在唯一的蛋白质模型的上下文中，个体朊病毒菌株被认为被编码为结构上不同的PrP 钪聚合1，2，3，11，12，13，14，15，16。然而，尽管最近取得的进展17，18，这些结构差异的性质仍然是定义不清，主要是因为与脑源性朊蛋白结构研究的基本技术困难。另一个混杂的问题涉及控制不同物种间疾病传播障碍的机制。数据的越来越多的表示这些障碍（或缺乏）从PRP中朊病毒应变特性物种依赖性氨基酸序列差异和之间的复杂相互作用导致3，14，19，20，21，22，23。然而，这种相互作用的分子水平细节仍然大部分是未知的。

在一系列研究中，我们已经使用由Y145Stop PrP的片段（PrP23-144）作为研究朊病毒传播的分子方面的模型形成淀粉样原纤维24，25，26。这种C末端截短的PrP变体与家族人朊病毒病的一个相关联27，28，和最近的研究表明，PrP23-144原纤维传染性，在小鼠中引起传染性神经变性疾病10。尽管在其他物种中没有报道类似的C-末端PrP截短，这个简单的模型使我们能够在体外复制哺乳动物朊病毒繁殖的某些方面，提供对种属依赖和菌株依赖的种子屏障机制的深入了解25，26。其中一个重要的发现是，接种特异性的关键决定因素是来自给定物种的PrP单体适应特定PrP23-144淀粉样蛋白菌株的结构的能力。然而，这种机制模式在本质上仍然是概念性的，在原子层面上缺乏描述。

PrP23-144淀粉样蛋白原纤维的独特优点是，不像其它哺乳动物朊病毒，该系统是通过固态核磁共振（NMR）光谱法易于进行高分辨率结构分析29，30，31。我们以前的结构研究主要集中于人类PrP23-144原纤维32，33，34，35，36，揭示了这些纤维的刚性β折叠芯由三个相对短的β链的残基112-141之间的区域内，并且该β-芯区域显示一个平行于寄存器组织32，33，34。在寄存器β-结构平行的这种总体主题是常见的由不同的PrP变体包括PrP90-231在体外形成的淀粉样蛋白37和全长蛋白38，39，即使最近的数据表明，至少某些菌株的结构脑源性朊病毒基于β螺线管基序40。在这里，我们报告固态核磁共振数据，提供了来自三个不同物种（人类，小鼠和叙利亚仓鼠）的PrP23-144原纤维之间的结构差异的初步高分辨率见解，并确定控制这些差异的特定氨基酸残基。此外，我们的研究表明，相同的氨基酸残基在相同氨基酸序列内出现结构不同的PrP23-144淀粉样蛋白原纤维菌株中起关键作用。这些结构性见解为更全面地了解种间朊病毒繁殖的交叉种子的分子基础提供了基础。

结果
控制PrP23-144淀粉样蛋白核心结构的残基
如前所述，新鲜溶解的PrP23-144是单体的且大部分是非结构化的，但是在温育后它转化为富β-折叠的淀粉样原纤维24。在本节中，我们描述人类，小鼠和叙利亚仓鼠PrP23-144淀粉样蛋白（分别称为[hu]，[mo]和[Sha]）的固态核磁共振研究，以及选择形成的淀粉样蛋白这些蛋白质的单或双点突变体，如方法部分所述，在25℃静止条件下产生。在这些条件下所有的PrP23-144的变体研究组装成微米长度淀粉样原纤维如在我们以前的使用原子力显微镜和硫磺素T荧光的研究证明24，25，26。此外，所有原纤维样品是在分子规模基于有效相同指纹的2D再现地均匀15 N- 13 Cα固态NMR谱记录多个独立的制剂（补充图  1为代表的数据）。

[Mo]和[Sha]原纤维的13 C和15 N化学位移分配是通过使用二维和三维固态核磁共振实验确定的，详见其他文献36。分配2D 15 N- 13 Cα光谱[MO]和[沙]原纤维在图中所示  1b中，C，分别与揭示的是，在非常类似于[胡淀粉样蛋白32，33时，[MO]和[ Sha]淀粉样蛋白各自含有跨越〜30个氨基酸（残基〜112-140）的相对刚性和紧凑的C-末端β-核心区域，其中蛋白质的其余部分动态无序。该主链的化学位移，尽管几乎相同的氨基酸序列（的原纤维对所有三个物种之间显着不同的发现13 Cα化学位移均方根偏差，δ（13 Cα）RMSD，发现为共同的残基值是1.9，2.3和1.9 ppm的为[胡]对[MO]，[胡]对[沙]和[MO]对[沙]，分别36）表示胡，Mo和ShaPrP23-144采用在原子水平上彼此不同的三维淀粉样蛋白β-核心结构。化学位移使用基于TALOS-N的二级结构分析41图总结了  图1A（也参见补充图  2为的曲线13点 Cα- 13 Cβ二次化学位移差），指向β-纤芯区域之间特别显著结构差异[hu]和[Sha]淀粉样蛋白：对于[hu]与两个延伸的β-链aa〜112-113，〜120-123和〜130-140具有特别高的β链倾向的三个片段aa 〜113-122和〜128-139，因为[Sha]。另一方面，尽管存在相当大的化学位移差异，但是[m]淀粉样蛋白似乎采取了与其[hu]对应物具有一些相似性的分子构象，三个预测的β-链跨越残基〜112-117，〜120- 126和〜130-141。值得注意的是，根据倾斜分析，[hu]，[mo]和[Sha]淀粉样蛋白都显示几乎相同的原纤维每长度质量（MPL），约为50-55kDa nm -1 - 束透射电子显微镜（TB-TEM）42（补充图  3）。对于之前已经发现组装成平行的寄存器内β-折叠结构34的 [hu]淀粉状蛋白，该MPL值对应于每0.47-nmβ片层重复间隔的两个PrP23-144分子。因此，所观察到的NMR化学位移差异所暗示的[hu]，[mo]和[Sha]淀粉样蛋白之间的结构多样性并不是纤维超分子结构中的大规模差异的结果。

图。1
图。1
二维15 N- 13 PrP23-144淀粉样蛋白原纤维的Cα固态NMR光谱。a，hu，mo和ShaPrP23-144 的氨基酸序列。位于淀粉样蛋白β核内且可在固态NMR光谱中观察到的不可移动残基以黑色字体显示，且不可检测，构象灵活的残基以红色字体显示。根据TALOS-N具有最高β链的残基倾向41描述化学位移基于二级结构分析先前36用表示灰色矩形。星号表示在hu，mo和ShaPrP23-144序列之间不保守的所有残基。b - ë二维15 N- 13 Cα指纹NMR记录在500或800MHz的PrP23-144淀粉样蛋白原纤维的谱1个 H两种频率，11.111千赫MAS率，和5℃。显示总共8种PrP23-144淀粉状蛋白的光谱，包括以下蛋白质及其单或双突变体：[hu]，[mo]，[Sha]，[hu M112V]，[hu I138M]，[hu I139M] ，[hu I138M / I139M]和[Sha M138I / M139I]，如插页和相应颜色的轮廓所示。在相应的颜色也示于b和c ^是用于共振分配[胡]，[Mo]及[沙原纤维32，36。f基于本研究中的固态NMR数据，关键氨基酸取代的总结主要是采用[hu]，[mo]或[Sha] - 样结构的PrP23-144淀粉状蛋白β核心
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采用生化和低分辨率生物物理技术以前的研究25，26已证明[胡]，[Mo]及[沙]淀粉样蛋白表现出不同的二级结构和形态，而这些特征是强与所观察到的特异性播种相关。值得注意的是，这些研究还鉴定了物种依赖性残基138和139（分别为hu，mo和ShaPrP23-144的Ile-Ile，Met-Ile和Met-Met）作为纤维化动力学，原纤维形态学和播种的关键决定因素特异性。为了评估PrP23-144淀粉样蛋白的原子结构，这些氨基酸的影响，我们记录的2D 15 N- 13 Cα固态NMR谱数PrP23-144变体靶向的残基138和139。图  1C示出了用于该NMR谱从huPrP23-144淀粉样Ile取代138和Ile 139（[胡I138M / I139M]）和[沙淀粉样蛋白的仓鼠状取代是有效相同（δ（13 Cα）RMSD = 0.2ppm的），表明更换这两个huPrP23-144中的异亮氨酸残基被甲硫氨酸足够驱动蛋白质组装成具有[Sha]特征的β核心结构而不是[hu]淀粉样蛋白的原纤维。为了进一步验证该发现，我们已经产生[沙M138I / M139I原纤维，为Met 138和Met 139 ShaPrP23-144由异亮氨酸取代，并获得15 N- 13 CαNMR谱（图  1C），该反射镜的那些[胡淀粉样蛋白（δ（13 Cα）RMSD = 0.1 ppm）表示。相比之下，huPrP23-144的类似实验（用单个小鼠PrP样Ile138用Met替换Met）意外地揭示[huI138M]淀粉样蛋白采用[hu]而不是[mo]样的折叠（图  1b ;δ 13 Cα）RMSD = 0.1ppm的为[胡]对[胡I138M]）。后一个结果表明，尽管I138M突变使huPrP23-144的纤维化动力学与moPrP23-144 25的纤维化动力学几乎相同，但是残余物的确切身份几乎没有最终的淀粉样蛋白结构。

意外发现残基138不是PrP23-144淀粉状蛋白结构的关键决定因素立即引发以下两个问题：（i）单独的I139M取代是否足以诱导huPrP23-144形成[Sha]样淀粉样蛋白结构？和（ii）huPrP23-144中的哪些氨基酸取代对于蛋白质组装成[mo]样淀粉样蛋白结构是关键的？

第一个问题的答案显然是肯定的，即I139M取代实际上充当[hu]和[Sha] - 样淀粉样蛋白β核心结构之间的唯一构象转换。此评估是基于以下发现，即在15 N- 13为[胡I139M原纤维（图CαNMR谱  1E）是有效地与用于[沙]对应频谱（以及[胡I138M / I139M]）的淀粉样蛋白。此外，[huI138M]，[huI138M / I139M]和[ShaM138I / M139I]淀粉状蛋白的NMR数据一起强烈表明，M139I突变同样足以将ShaPrP23-144的淀粉状蛋白核心折叠从[沙]到[hu] -like。

为了鉴定对于将huPrP23-144转化成[mo]样淀粉样蛋白结构最关键的氨基酸，我们注意到在β-核心区域的紧邻处hu和mo PrP23-144仅在四个位置：M109L，M112V，I138M和S143N（图  1a），其中残基112和138是仅有的在传统基于偶极耦合的固态NMR光谱中不能移动的可检测的。鉴于已经证明I138M取代对[hu]淀粉样蛋白的结构没有影响（图  1b和上面的讨论），我们将注意力转移到位于β核心区的N-末端边缘的残基112 [hu] and [mo] amyloids。在图  1d中，我们比较了15 N- 13记录[胡]CαNMR光谱，[Mo]及[胡M112V原纤维（注意[胡M112V / I138M淀粉样蛋白还研究并发现是几乎相同[hu M112V]）。尽管[hu M112V]和[mo]淀粉样蛋白之间的光谱重叠程度不如[hu I139M]和[Sha]之间的光谱重叠程度，但显然M112V突变本身足以显着干扰[hu]并产生显示[mo]淀粉样蛋白的许多光谱（因此也可能是结构性）特征的原纤维，其残余差异可能与残基109和/或143的确切同一性有关。

综合上述固态核磁共振研究表明[hu]，[mo]和[Sha]原纤维在原子水平上采用不同的淀粉样β核心结构，这些结构差异主要由仅有的身份位于结构化淀粉样蛋白核心区域边缘的两个残基（112和139）。如图1f中总结的  ，huPrP23-144中的I139M取代足以使蛋白质采用[Sha]样淀粉样蛋白核心结构，而M112V取代似乎主要负责将huPrP23-144转化为[ mo]状结构。

用残基112和139控制核心结构的基础
对稳定不同PrP23-144变体的淀粉样核心区域所涉及的蛋白质骨架和侧链相互作用的完整原子理解需要确定其高分辨率结构 - 这是我们实验室目前正在进行的一项主要工作。在本研究中，已经建立了控制PrP23-144淀粉样蛋白结构中的物种特异性差异的氨基酸残基的身份，我们将注意力集中在对这些差异的结构基础的基本检查上。在图  2a中，我们示出了2D的小区域13 C- 13 Ç偶极辅助旋转共振（DARR）相关频谱43记录有长偶极混合时间（，τ 混合  = 500毫秒）以突出显示键远距离通空间13 C- 13 C触点，对于[胡]从huPrP23-144产生的原纤维与3-表示13 C-丙酮酸盐作为唯一碳源44。下在我们的研究中使用的实验条件下使用3- 13 C-丙酮酸盐包含13级在多个在位置C的标签，用Ala-Cβ，异亮氨酸，Cγ，VAL-Cγ，和Leu-Cδ甲基的特别有效的标签，而减少相邻13 C位点之间强烈的13 C- 13 C偶极偶联的数量，这会在均一的13 C-富集蛋白45中导致偶极截断现象45。

图2
图2
人类PrP23-144淀粉样蛋白β核心的关键的interresidue接触和示意图模型。用由3- 13 C-丙酮酸作为碳源表达的huPrP23-144产生的淀粉状蛋白原纤维以500毫秒的混合时间记录的900MHz 二维13 C - 13 C DARR固态NMR光谱的小区域。的光谱区域包含上的[胡淀粉样蛋白核心中明确的远程相关性的形式结构的关键限制（由指示的X标记下面之间）13个C原子：A117Cβ-I139Cγ2，A117Cβ-I139Cδ，A117Cα-P137Cα，和G119Cα-S135Cβ。b基于固态NMR和倾斜束透射电子显微镜数据结合的[hu]淀粉样蛋白核的示意模型（详见文本）。在此模型中[胡]淀粉样蛋白原纤维在C由两个原丝的2与平行于长原纤轴的β折叠区域-对称布置。本文中讨论的对PrP23-144淀粉状蛋白所采用的结构具有重大影响的氨基酸残基112,117和139的大致位置由红色球体表示
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所述13个 C- 13由A117-P137和G119-S135联轴器进一步支持残基A117和I139的侧链C之间频谱显示明确的，激烈的远距离相关（由指示的X标记在图  2a中），在L125的侧链和残基G114和A115之间观察到另外的接触。在13 C，15 N标记和天然丰度huPrP23-144的摩尔比为1:3（补充图  4）的物理混合物制备的稀释原纤维样品上进行的对照固态NMR实验表明，这些相关性是分子内至少部分来自相邻股线在并行寄存器内的β折叠中的额外可能的贡献。另一方面，涉及I138侧链的相关性主要是残基内的或局限于邻近的氨基酸。与MPL数据（参见，补充图。合并的  3），并且指纹固态NMR光谱[胡淀粉样显示单个组共振的事实32，33，这些突出远距离接触，使我们能提出一种为[胡]在C由两个原丝的纤维示意性结构模型2与如图平行于长原纤轴线延伸的β折叠区域-对称布置。  图2b。尽管很大程度上仍然是定性的，这种模式是与我们先前的研究报道了额外的实验观察结果一致32，33。值得注意的是，在基于偶极耦合的固态NMR化学位移相关光谱中具有最低的横向核自旋松弛速率和相应的最高信号强度的残留物〜115-122，并且在冷冻水合原纤维记录的光谱中表现出最不均匀的谱线展宽样品，构成紧密的，位于原纤维内部的富含Ala，Gly和Val的疏水核心。另一方面，在原纤维外部发现C-末端β-链中的〜130-139残基，使残基R136的侧链（存在于[hu]β淀粉样蛋白核心中的唯一带电氨基酸）突入溶剂中。最后，结构模型容易通过允许其延伸出淀粉样蛋白核心结构域而没有立体冲突而容纳约90个残基的动态无序N-末端尾部。

图2b中的[hu]淀粉样蛋白的示意模型  产生了几个重要的见解，使我们能够合理化不同PrP23-144变体的固态NMR分析结果。首先，关键的淀粉样蛋白结构决定残基112和139位于β-核心的边缘，并且足够接近以允许该区域中的氨基酸侧链之间的直接相互作用。因此，这些残基的物种特异性置换可以充当“构象转换”，其最终影响PrP23-144淀粉状蛋白的整体结构。其次，I139侧链在疏水核心中指向A117的事实和在相反方向上的相邻残基的侧链指向相反的方向，表明I138侧链指向远离淀粉样核心 - 例如拓扑结构提供了为什么I138M突变对[hu]淀粉样蛋白所采用的结构没有明显影响的原因。最后，基于发现残基A117和I139的侧链紧密接近的发现，并且相对保守的I139M取代对[hu]原纤维结构将其转化成[Sha]样的主要作用我们假设[hu]原纤维中这两个残基的侧链参与特定的疏水相互作用，稳定淀粉样蛋白β核并且通过它们的大小互补性而被加强（即，小的丙氨酸侧链与较大的异亮氨酸）。

为了检验这一假设，我们研究了由huPrP23-144的A117V变体形成的淀粉样蛋白，其组装成原纤维，具有与先前报道的野生型蛋白相似的原纤维46，但是具有较小的疏水性丙氨酸残基缬氨酸。基于图2中的固态NMR数据和结构模型  ，我们预计残基117和139的侧链之间的稳定化[hu]淀粉状蛋白的假定接触受到这种Ala到Val取代的干扰。事实上，如图3所示  ，我们发现[hu A117V]淀粉样蛋白的指纹固态NMR谱与[hu]淀粉样蛋白（以及[mo]和[Sha]淀粉样蛋白）的指纹固态NMR谱显着不同。基于使用2D和3D固态NMR（图3b）和随后的TALOS-N二级结构预测（图  3a和补充图  5）建立的顺序共振分配  ，似乎用更大的缬氨酸取代A117残基起到显着改变[hu]β淀粉样蛋白结构的作用。具体而言，我们发现[hu A117V]淀粉样蛋白的刚性核心区域相对于[hu]缩短，跨越残基〜121-137（相对于[hu]中的〜112-141），其中大多数预测采用β折叠拓扑。最显着的是，来自残基117和139的信号在[hu A117V]原纤维的基于偶极耦合的固态NMR光谱中完全不被检测到，表明这些残基变得更加灵活并且不再是刚性淀粉样核心结构域的一部分。这一发现与[hu]淀粉样蛋白中A117和I139侧链的直接和高度特异性相互作用的存在一致表明，当这种关键相互作用受到干扰时，PrP23-144淀粉样蛋白β核心采用替代热力学稳定的折叠。

图表,原文等:
https://www.nature.com/articles/s41467-017-00794-z



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邓文龙

图3
图3
二维15 N- 13由人类PrP23-144的A117V突变体形成的淀粉样蛋白原纤维的Cα固态NMR光谱。a huPrP23-144和huPrP23-144A117V 的氨基酸序列，突变位点用星号表示。位于淀粉样蛋白核心和构象灵活残基内的不可移动残基分别以黑色和红色字体显示。基于TALOS-N 41分析的具有最高β链倾向的残基用灰色矩形表示（参见图  1和补充图  5）。b分配二维15 N- 13 Cα指纹的固态NMR光谱[胡A117V]淀粉样蛋白原纤维（红色等值线），具有相应的频谱重叠[胡淀粉样蛋白（蓝色轮廓）
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PrP23-144淀粉状蛋白多态性和新的结构菌株
接下来，我们提出这样一个问题，除了PrP23-144淀粉状蛋白结构的物种特异性差异的关键决定因素之外，残基112和139还可能在分子水平多态性和淀粉状蛋白原纤维的不同结构菌株的出现中起作用。为了探索这个问题，除了在25℃下在静止条件下（表示为q25）制备的前面部分中描述的原纤维之外，我们还检查了在37℃以8rpm连续旋转产生的PrP23-144原纤维（表示为r37 ）如方法部分所述。图  4的指纹进行比较15 N- 13为[胡]，[胡I138M]，[Mo]的Cα固体NMR光谱，并在这两组的条件制备沙：淀粉样蛋白。这些光谱显示[hu]（图  4a）和[hu I138M]（图  4b）淀粉样蛋白在两种条件下采用有效的相同核心结构。另一方面，[mo] q25和[mo] r37原纤维（图4c）的光谱以及[Sha] q25和[Sha] r37原纤维的光谱之间存在显着的化学位移差异  。  4d），这表明结构上不同的淀粉样蛋白菌株可以由这些蛋白质根据实验条件形成。

图4
图4
15 N- 13在25℃静止条件下，在37℃下用旋转产生PrP23-144原纤维的Cα固态NMR光谱。分配二维15 N- 13 Cα指纹固态NMR光谱示于Q25（蓝色轮廓）和R37（红色轮廓）淀粉样蛋白纤维如插图所示为一个胡，b胡I138M，Ç MO，和d沙PrP23-144
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尽管在指纹明显的差异15 N- 13 Cα固体NMR光谱中，13 C和15个 Ñ化学位移分配指示[MO]和[沙]菌株的刚性β-芯区域中的Q25和R37的条件下得到在每种情况下由〜30个C端残基组成。此外，在两组条件下制备的[mo]和[Sha]原纤维具有相似的MPL值（补充图  6）。因此，在本研究中产生的[mo]和[Sha]淀粉样蛋白菌株具有相似大小的核心区域，并且由相同数量的原丝组成，这些菌株之间的结构差异发生在β内折叠模式的水平核心区域。

通常需要升高的温度和非静止的生长条件才能进入这些交替的[Mo]和[Sha]核心结构。具体而言，对于moPrP23-144，在没有搅拌的情况下，在25℃或升高的37℃温度下使用连续旋转产生的淀粉状蛋白与在q25条件（补充图7A）下获得的淀粉状蛋白有效地相同  ; 只有37℃的温度和连续旋转的组合才能得到具有独特的指纹固态NMR光谱的原纤维。对于ShaPrP23-144，在25℃或37℃不旋转的条件下获得的淀粉样蛋白实际上是不可区分的，并且对于在25℃下连续旋转制备的样品开始出现一些光谱变化，所得到的淀粉样蛋白明显不同于在37℃旋转时获得的应变（补充图  7B）。

最后，我们注意到，在旋转的37°C下产生的[mo]和[Sha]淀粉样蛋白，有时在相同的宏观原纤维制备中可以观察到两种或多种结构多晶型物（代表性数据的补充图  8）到与图1和2所示的NMR谱相关的单一“纯”菌株。 4和5。对于[Sha]原纤维而言，此类多态性制剂通常是纯q25和r37菌株的二元混合物（补充图  8A）。然而，对于一些[mo]制剂，可以得到与几种淀粉样蛋白菌株的混合物一致的更加复杂的指纹NMR谱（补充图  8B）。然而，最显着的是，我们发现在r37条件下变得可接近的[mo]结构菌株中的一个在原子水平上显示出与[hu]淀粉样蛋白几乎相同的三维折叠，基于高度在信号重叠15 N- 13 Cα指纹NMR谱（图  5B）。相反，在r37条件下获得的[Sha]原纤维具有与任何其他PrP23-144淀粉样蛋白结构明显不同的β核心折叠。

图5
图5
15 N- 13 PrP23-144原纤维在37℃Cα固态核磁共振谱与淀粉样蛋白组件的旋转和能量景观图。一个 - ç分配二维15 N- 13 Cα指纹的固态NMR谱一个 [胡]，b [MO]，和Ç沙：淀粉样蛋白在37℃下连续样品旋转产生在8 RPM原纤维（红轮廓，在插图中标记为[hu] r37，[mo] r37和[Sha] r37）。每个图中重叠的是在25℃静止条件下（q25，蓝色轮廓）产生的huPrP23-144原纤维的谱图。d与[hu]，[mo]和[Sha]淀粉状蛋白原纤维形成相关联的示意图能量景观图，其具有热力学最稳定的“基态”和潜在的交替的“激发态”淀粉状蛋白褶皱，表示为“G”和“E” ， 分别。淀粉状态中每种蛋白质的能量状态中的基态被指定为在25℃（q25）静止条件下采用的结构，因为在这些条件下，这些蛋白质中的每一种都采用独特的（可能是最低的自由能）倍数即使在非静止条件下也可以填充一些样品。在本研究中在37℃下旋转的特定非静止条件（r37）下，[hu]淀粉样蛋白的折叠保持不变，而mo和Sha蛋白能够通过热力学和动力学因素。其他细节在文中提供
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如图5d所示  ，上述发现有力地表明，当从能量景观的角度考虑时，[hu]淀粉样蛋白核折叠成热力学稳定的“基态”结构（在图5d中表示为“G”  ），在本研究中研究的整个实验聚集条件范围。尽管huPrP23-144也可能会采用交替的“激发态”核心结构（在图5d中由“E”表示  ），但是这些结构似乎具有相对于基态折叠足够高的能量，使得它们是在这里探讨的条件下显然无法访问。与此相反，在高温下搅拌的情况下，新的[Mo]和[Sha]多晶型物很容易出现（参见图  4c，d），这些蛋白质表现出更加崎岖的能量景观，其特征在于存在at至少一个交替的淀粉样蛋白核心结构，其能量与最热力学稳定的基态折叠相当。鉴于残基112和139对q25条件下不同PrP23-144变体所采用的β-核心结构的影响，极有可能相同的氨基酸主要负责改变mo和ShaPrP23- 144，并且通过热力学和动力学因素的组合，导致在r37条件下这些蛋白质出现具有不同三维核心折叠的新的淀粉样蛋白菌株。

讨论
朊病毒疾病中令人困惑和难以理解的方面之一是种间传递障碍现象。动物研究和体外实验有限表明，高效朊病毒传输需要的PrP的单体基材的“构象的适应性”到特定的朊病毒聚集体的结构3，14。该模型假定氨基酸序列变异性允许不同哺乳动物物种中的大量朊病毒构象（菌株），但是这些结构的一个子集在给定物种（即，对于给定的氨基酸序列）中是热力学可接近的。如果特定供体朊病毒株的结构在宿主的PrP可接近的构象异构体的范围内，则会发生传播。相反，如果传入的朊病毒株的结构与主体PrP所允许的构象谱不相容，这将导致传递障碍。即使通过体内和体外许多观察的支持3，14，26，的传递障碍这种模式在本质上是概念性的大部分，缺乏分子水平说明。这样的描述将需要从不同物种分离的朊病毒毒株的详细结构表征以及关于特定氨基酸残基在形成这些结构中的作用的信息。然而，高分辨率结构研究与脑源性朊病毒存在重大的技术挑战，还有待克服。

以前的研究表明，朊病毒毒株和传递率（播种）障碍的现象可以在体外使用从C末端截短的变体的PrP形成PrP23-144淀粉样蛋白原纤维被再现25，26。尽管后一种体系不能概括朊病毒在体内繁殖的全部复杂性，但这些研究提供的机制观点在概念上与动物实验中出现的图像一致。这与PrP23-144淀粉样蛋白纤丝到高分辨率结构表征通过固态NMR光谱法的顺从在一起32，33，34，35，36和最近发现的是，这些纤维是感染10，表明该系统可以是独特的在结构层面上探索传导障碍的机械原理的价值。

在本研究中，我们使用固态核磁共振来获得对三种不同物种（人，小鼠和叙利亚仓鼠）的PrP23-144淀粉样蛋白原纤维之间结构差异性质的初步高分辨率的了解。原子力显微镜和红外光谱的低分辨率研究结果表明[hu]和[Sha]之间的结构差异受残基138和139 26控制，两者都被huPrP中的Ile和ShaPrP中的Met所占据。然而，目前的高分辨率实验最终证明，这些结构差异的唯一决定因素是139位氨基酸的性质，因为该残基的物种特异性取代足以将[hu ]淀粉样蛋白对[Sha]淀粉样蛋白的特征。固态核磁共振数据分析也显示，在静止原纤维生长条件下，[hu]和[mo]淀粉体在原子水平上采用不同的结构。在以前的低分辨率研究中没有发现这种差异。类似于[hu]和[Sha]对，[hu]和[mo]淀粉样蛋白之间的结构差异似乎主要由单个氨基酸残基控制。然而，在这种情况下，关键残基位于112位，huPrP被Met占据，Val被moPrP占据（两个蛋白在位置139都具有Ile）。在[hu]淀粉状蛋白的位置138处的物种特异性Ile至Met取代没有观察到光谱差异，进一步证实残基138的同一性对于PrP23-144淀粉状蛋白原纤维的结构几乎没有影响。

残基112和139作为物种依赖性结构差异的决定因素的关键作用可以通过检查基于固态核磁共振的[胡]淀粉样蛋白平行寄存器β-结构示意模型来合理化（图  2b） 。如结果部分详细描述的，单个单体以这样的方式折叠：位于β淀粉样蛋白核心的相对末端的M112和I139侧链指向该核心的内部，并且充分接近每个其他和另外的疏水性侧链以允许直接相互作用。因此，这两个残基中任一个的物种特异性置换可以作为构象转换，影响PrP23-144淀粉样蛋白的整体结构。另一方面，I138的侧链远离β核心，不参与与其它侧链的任何直接相互作用。这也许可以解释为什么Ile 138与Met的物种依赖性替代对[hu]淀粉样蛋白的结构没有影响。

尽管在将模型系统中的观察推断到体内情况时应当谨慎，但是我们发现残基139是PrP23-144淀粉状蛋白原纤维之间的物种依赖性结构差异的关键决定因素之一，与之前的报道一致，将残余物在此位置（或其等同物）的是不同的物种之间朊病毒传递障碍的主要决定因素22，47。另一方面，鉴于以前的观察结果，相同的氨基酸置换对于动力学的影响主要是由于PrP23-144淀粉样蛋白的结构对于PrP23-144淀粉样蛋白结构的影响很小淀粉样蛋白形成，大大影响滞后期25。后一发现提示残基138的侧链可能直接参与分子间和/或分子内相互作用，导致聚合核的形成，其本质上可能是寡聚体。然而，这些早期的相互作用似乎并没有保留在最后的淀粉样蛋白结构中，因为在后者中残基138的侧链不与其它侧链接触。相反，112位氨基酸残基的同一性影响PrP23-144淀粉样蛋白的最终结构，但根据之前的数据25，不涉及淀粉样蛋白形成的动力学。因此，似乎PrP23-144中个别氨基酸残基对成核过程的影响与这些残基对最终淀粉状蛋白β核心结构的影响之间没有直接联系。在病原生物学环境中，相信核形成在散发性朊病毒疾病中从头形成朊蛋白起着关键作用，而朊病毒聚集体的特定结构是传递障碍的关键决定因素。

也许更有趣的是在人类和小鼠PrP23-144在相同静态条件下形成的淀粉样蛋白在结构上是不同的，而在这两种物质的蛋白质之间没有观察到种子屏障（即[hu]淀粉样蛋白能种子纤维化moPrP23-144和[Mo]的淀粉样蛋白的种子可以通过huPrP23-144淀粉样蛋白形成）25，26。在先前提出的构象适应性模型26的背景下，这种交叉杂交相容性将表明[hu]淀粉样蛋白的结构在moPrP23-144可以采用的结构范围内，并且[mo]的结构是在huPrP23-144可用的结构范围内。我们的观察支持这种构象适应性的可能性，即使在原子水平上在结构上不同，在q25条件下形成的[hu]和[mo]淀粉样蛋白显示出与相似的总β核心褶皱相一致的相似的二级结构。此外，我们的数据表明，在r37条件下，moPrP23-144可以装配成几种结构不同的淀粉样蛋白菌株，其中一种似乎与[hu]淀粉样蛋白有效相同。结构多态性似乎是许多不同蛋白质形成的淀粉样蛋白的一般性质（最近的综述见参考文献48）。此外，最近的数据表明，朊病毒，这往往存在作为多个菌株的池，可经历进化适应环境，这个过程可以潜在地导致选择一个特定的朊病毒菌株的大多数有效复制在给定环境49，50。需要进一步的研究来确定这种选择是否会发生在结构异质的[mo] r37淀粉样蛋白种群的反应中。

另一种可能是，横播种可能导致“应变切换”，一个知之甚少现象两种酵母和哺乳动物朊病毒观察到3，14，51，52，53。一个可能导致这种应变转换的假设机制提出，新招募的单体对种子结构的适应仅发生在β-核心的部分内，而在该关键区域之外的构象特征可能由固有的（基于序列的）喜好，而不是由种子模板46。本发现为通过系统分析在交叉反应中产生的PrP23-144淀粉状蛋白的结构提供了对这些不同可能性的严格测试的垫脚石。此外，即使已知PrP的23-144区域之外的另外的氨基酸残基也在物种屏障中起到朊病毒可传递性的作用，但是对实验可获得的PrP23-144淀粉样蛋白模型系统中的交叉种子屏障的机理性认识为未来的研究提供了一个概念框架，由全长PrP形成的感染性聚集体。然而，后者系统的高分辨率固态NMR实验目前受到诸如由现有可用方法从重组全长PrP产生的高度感染性材料的数量不足和异质性等因素的阻碍。

方法
蛋白质表达和纯化
编码人，小鼠和仓鼠叙利亚PrP23-144，用含有他的N-末端的连接体的质粒6 -tag和凝血酶切割位点，先前描述的25，54。使用补充表1中所列的引物和QuikChange II位点特异性引物通过定点诱变产生hu M112V，A117V，I138M，I139M，M112V / I138M，I138M / I139M和ShaM138I / M139I PrP23-144的表达构建体。  定向诱变方案（Stratagene），并通过对整个基因（Genewiz）进行测序证实。同位素13 C，15种 Ñ富集PrP23-144变体在表达大肠杆菌 BL21（DE3）细胞用含有M9基本培养基15 NH 4氯（1克L- -1）和13 C-葡萄糖，1,3- 13 C-甘油（2克L- -1），2- 13 C-甘油（2克L- -1），或3- 13 C-丙酮酸盐（3克L- -1）作为氮源和碳源，分别和由镍纯化使用Ni-NTA树脂（Qiagen）进行亲和层析，然后使用生物素化的凝血酶（Novagen）切割N-末端His 6 -标签，使用链霉亲和素 - 琼脂糖珠（Novagen）螯合凝血酶，并除去残余的His 6通过针对超纯水透析-tag 32，36，54。

用于固态NMR分析的PrP23-144淀粉状蛋白原纤维
通过添加1M磷酸钾pH6.4的缓冲液至50mM的终浓度，于400μM制备淀粉样蛋白原纤维（〜5毫克毫升-1）PrP23-144的超纯水中的溶液36。本研究中大多数PrP23-144原纤维样品是在25℃静止条件下（表示为q25）产生的，其中原纤维悬浮液大部分未受干扰地孵育，除了每12小时温和倒转样品管以确保完全混合36。此外，如结果和讨论部分所示，在静止条件（表示为q37）和在25或37℃连续旋转8rpm（分别表示为r25和r37）下，在37℃下制备了几种淀粉状蛋白原纤维样品。注意，取决于PrP23-144序列，通过TEM评估单体到成熟原纤维的定量转化，并在样品离心后监测上清液的UV光谱，通常在r-6条件下〜6-24h内完成在q25条件下约2-7天。原子力显微镜按常规用于表征所得PrP23-144淀粉样原纤维26，36，随后被用在50mM磷酸钾pH 6.4缓冲液中，并通过离心转移至3.2mm固态NMR氧化锆转子36。

固态NMR光谱学
使用配备有3.2mm BioMAS 1 H- 13 C- 15 N探针和配备有3.2mm Efree 1 H- 13 C的800MHz Bruker Avance III HD光谱仪的500MHz Varian VNMRS光谱仪收集顺序谐振指定的NMR数据- 15 N探头。的13 C和15如在我们以前的研究描述建立Ñ共振分配32，36，使用一组2D和3D化学位移相关光谱包括15 N- 13 Cα，15 N- 13 Cα- 13 CX，15 N- 13 C- 13 CX，和13 C- 15 N- 13 Cα。在配备有Bruker Avance III控制台的900MHz超宽孔仪器55和3.2mm的灵敏度测量仪器上，在National High Magnetic Field Laboratory（NHMFL）上记录具有500ms混合时间的2D 13 C- 13 C DARR 43相关谱。增强低辐射探头设计和建造NHMFL 56，57。所有的NMR实验都是在魔角旋转频率为11.111kHz，有效样品温度为5℃的条件下进行的。NMR数据在NMR管58中处理，并在Sparky 59和nmrglue 60中分析。

图表,原文等:
https://www.nature.com/articles/s41467-017-00794-z



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