人类巨细胞病毒感染

顾汉现

人类巨细胞病毒感染

    【概述】

人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV，或简称CMV）属疱疹病毒科，在人群中具有较高的感染率，在发达国家成人中感染率为40％～60％，发展中国家可高达100％，在我国同样具有很高的感染率。初次感染后常呈潜伏感染状态，并在免疫力低下（如器官移植后，AIDS等）时再活化而导致严重感染。CMV感染还与动脉粥样硬化、冠心病、肝炎、病毒性眼病、肾小球肾炎、特发性血小板减少性紫癜等具有相关性。另外先天性感染导致流产、死胎、早产比较常见。实验室检查可从病毒抗体、病毒抗原以及病毒核酸多方面进行，从定性到定量检测。在治疗方面，除抗病毒药物、干扰素、转移因子以及免疫球蛋白外，疫苗的研制为临床治疗带来了希望。

    【流行病学】

       分布特点

HCMV感染遍布全球，感染率很高，在不同种族、不同地区人群中感染率有所差别，社会经济状况较好、较发达地区的成年人感染率较低。北美和欧洲成年人群中血清抗体阳性率为50％～80％，而亚洲与非洲等发展中地区的人群中血清抗体阳性率近100％。多数人在幼年或青年时期获得感染，随着年龄的增长，血清抗体阳性率增高。

       传染病学特征

1．传染源　患者和隐性感染者的血液、唾液、尿液、泌尿生殖道分泌物以及乳汁等均可长期或间歇地排出病毒，作为传染源。

2．传播途径　可有通过胎内感染的先天性感染；通过密切接触引起的接触感染，多通过尿液、唾液、宫颈阴道分泌物、乳汁等；通过输血、器官移植、骨髓移植、心脏手术等传播。

3．易感人群　易感性取决于年龄、免疫状态、经济情况等。宫内未成熟胎儿最易感，年长儿童和青壮年以隐性感染多见。免疫功能低下者，如器官、骨髓移植、恶性肿瘤、艾滋病、接受免疫抑制治疗、放疗、化疗等情况下，体内潜伏的病毒再活化，由隐性感染转为显性感染，且常常导致较为严重的感染。

    【病因与发病机制】

1．形态学及一般生物学特性　1956年由Smith和Weller等分别首次自患者组织中分离出HCMV。由于被感染的组织细胞增大，并具有巨大的核内包涵体，故而命名为巨细胞病毒。HCMV属疱疹病毒科β亚科，具有极高的种族特异性，人类是其目前已知的惟一宿主。不同毒株间核苷酸序列具有80％以上的同源性，有共同抗原，暂定为一个血清型，因此在临床检测上可以不受毒株型别影响。HCMV为180～250nm直径的二十面体，是疱疹病毒科中最大的成员。由三部分组成：核、衣壳和包膜。核心呈球状，直径约64nm，外包衣壳，直径约为110nm，最外层为包膜。
    HCMV对脂溶剂及极端的物理条件非常敏感，在20％乙醚中最多存活2h。对冻融不稳定。pH<5，或置于56℃ 30min，或紫外线照射5min可被充分灭活，10％的漂白粉可使其感染性明显降低。保存病毒时，应将其迅速冰冻，保存于－80℃或液氮中，可保存3年。感染了病毒的细胞悬液，保存时需加入10％血清以及10％DMSO，置－80℃或液氮中保存。

2．分子结构及基因的表达与调控　HCMV为双股线性DNA病毒，分子量为（150～160）×106Da，大小为240kb。其基因组分为两个区，一个短单一序列（Us）和长单一序列（Ul），Us区和Ul区的两侧各有一个反向重复序列，分别称为IRs、TRs和IRl TRl。由于Us和Ul可以以任一方向排列，所以HCMV DNA分子以等分子浓度的四个异构形式存在。
    HCMV的基因分为IE（即刻早期），E（早期）和L（晚期）三类，这些蛋白基因连锁调控，呈时序级联地相继表达，至少编码氨基酸残基数100以上的多肽200余种。其特异的蛋白质有：结构蛋白、非结构蛋白和病毒相关的酶类。结构蛋白是指存在于病毒颗粒中的蛋白质，如gB、gH等，其功能包括，如gB参与病毒与宿主细胞膜的吸附与融合过程；gH亦介导病毒与宿主细胞膜的融合；pp71是IE基因转录的反式激活诱导剂；pp65有蛋白激酶活性。非结构蛋白指存在于感染细胞中的，病毒合成代谢所必需的酶类，如DNA结合蛋白等。病毒相关的酶类，如DNA聚合酶等。
    IE区位于Ul一个小于20kb的区段内，IE基因由4个外显子（IE1、IE2、IE3、IE4）和3个内含子组成。IE期发生在感染后0～2h，通过细胞RNA多聚酶Ⅱ，立即转录合成IEP，该期无病毒DNA复制，IE抗原（IEA）主要包括IE1（UL123）和IE2（UL122）蛋白，在感染后1h开始出现在感染细胞核内。IE基因产物激活早期基因的启动子，早期基因一旦合成，病毒DNA复制和晚期基因的合成随即开始。早期抗原（EA）在感染后2～4h出现，为一组合成子代DNA和蛋白质所需的酶和调控因子，如病毒DNA多聚酶（UL54）、核DNA结合蛋白（UL57）和一组核磷蛋白（UL112）。另一种核DNA结合磷蛋白（UL44）在感染早期和晚期表达，可促进病毒DNA多聚酶的活性。晚期抗原（LA）在感染后6～24h内表达，为病毒结构蛋白，该期以大量病毒结构蛋白产生及感染性毒粒释放为其特征。目前已将IEA、EA和LA中的下基质蛋白pp65作为临床检验CMV存在的主要抗原依据。

    【病理】

HCMV与被感染细胞的胞膜融合后或经吞饮作用进入宿主细胞，主要病理特征是受感染细胞的体积增大，约增大3～4倍，直径达25～40μm，胞质内首先出现直径为2～4μm的、位于胞浆边缘的嗜碱性或双嗜性包涵体；随之在位于核中央处出现直径为10～15μm的嗜酸性包涵体，占核中央区的大部分，其周围有一境界分明的晕轮与核膜分离，酷似猫头鹰眼。病毒可侵犯全身所有器官，引起细胞溶解、灶性坏死及细胞炎症反应。主要包括肺、肝、肾、脾、脑、胰、肾上腺、视网膜、涎腺及消化道，尤其对上皮和内皮细胞具有亲和性。可引起脑弥漫性或局灶性坏死、广泛钙化，肝、肾上腺局灶性坏死，坏死性间质性肺炎、肾脏皮质单核细胞浸润等。HCMV在年长儿童或成人中的原发感染常会出现与EB病毒感染类似的单核细胞增多症表现，外周血中出现异常淋巴细胞。此外HCMV感染还可引起包括浆细胞、淋巴细胞以及单核-巨噬细胞等在内的细胞炎症反应，尤在肝脏中具有典型反应。

    【诊断要点】

       诊断要点概述

根据临床表现，尤其在易感人群中（如婴幼儿、接受器官、骨髓移植、免疫低下等患者）出现上述临床症状，均应考虑HCMV感染。还应结合相应的影像学检查结果，如间质性肺炎的X线表现。确诊有赖于实验室检查，包括在患者体液或活检组织中分离检测到病毒或找到包涵体；血清学抗体检测以及病毒抗原或核酸的检测（详见下述内容）。

       临床表现

根据临床感染情况分为以下几种类型。
    （1）先天性感染：病情可轻可重，严重者表现为黄疸、肝脾大、瘀点状皮疹，可累及泌尿、中枢神经等多系统，可见小头畸形、运动障碍、脉络膜视网膜炎，可致流产、死胎、早产等。即使胎儿出生后，可出现呼吸道感染、肝脾大、神经系统受累等，病死率较高，幸存者可出现智力低下、畸形等后遗症。文献报道如果母亲在早孕期间首次感染HCMV，其导致胎儿感染的可能性以及感染程度比复发感染的孕妇要严重。先天性感染是最常见的HCMV感染，约占总病例的25％。

（2）后天获得性感染：儿童感染HCMV后，多无症状，偶有肝大伴肝功能损害，尿和唾液中可持续数月排出病毒。正常成人感染HCMV后，多表现为隐性感染，无明显临床症状，或有类似传染性单核细胞增多症表现，如发热、头痛、喉痛、肌痛、肝脾大、淋巴细胞相对或绝对增多，可出现异常淋巴细胞。临床上需借助实验室检查和EB病毒引起的单核细胞增多症进行鉴别。

（3）免疫低下者的HCMV感染：初次感染HCMV后常呈潜伏感染状态，并在免疫力低下（如器官、骨髓移植后、AIDS、应用免疫抑制药等）时再活化而导致严重感染，是造成免疫抑制和免疫低下患者机会感染的重要病原微生物。
    ①移植受者的HCMV感染：移植受者的1/3会发展为巨细胞病毒病，1/2会发生肺部感染，最终会导致50％的死亡率。在骨髓移植中，巨细胞病毒病的死亡率达30％～70％，仅次于移植物抗宿主细胞病，成为影响骨髓移植成败的重要因素。同样在肾脏、心脏、肝脏移植术后60％～100％的患者伴发HCMV感染，具有高死亡率。HCMV肺炎是最常见死亡原因。HCMV感染后历经感染期、病毒血症期、巨细胞病毒病期三个阶段，而一旦进入巨细胞病毒病期，药物治疗往往失败，所以在接受移植的患者中进行病毒监测，做到早诊断、早治疗显得格外重要，研究显示在移植受者和供者同为血清抗体阴性，则移植后感染HCMV的概率小于受者阴性和（或）供者阳性；受者阳性，无论供者是否阳性，则均有较高的感染机会。虽然目前在移植前进行血清抗体检测，但在我国，一方面正常成人HCMV血清抗体80％～100％阳性，另一方面供体的不足，所以难以在此方面来降低HCMV感染率。
    ②艾滋病患者的HCMV感染：HCMV被认为是艾滋病患者继发感染的重要病原体，研究表明约24％的艾滋病患者在发病2年内发生HCMV重症感染，HCMV重症感染将导致艾滋病患者提早死亡，尸体解剖发现90％的艾滋病患者有HCMV显性感染。显性感染主要发生于CD4+淋巴细胞数低于50～100/μl的患者。艾滋病患者的HCMV感染可累及全身多个器官，最为常见的是肺部、中枢神经系统和胃肠道，HCMV肺炎往往是死亡主要原因。中枢神经系统感染常累及视网膜导致严重的视网膜炎，最后失明。

（4）HCMV感染主要累及的器官：免疫抑制和免疫缺陷者HCMV感染的主要临床表现有持久不规则的发热、不适、食欲减退，伴极度乏力、肌痛、关节痛、恶心、盗汗、肝功能异常、白细胞减少或增多。最明显的受损器官为肺脏，出现呼吸困难、缺氧和干咳等症状，肺部X线检查显示两肺呈间质性、网状及结节状浸润。HCMV感染也可引起胃肠道损害，食管、胃、小肠或大肠溃疡，可致出血或穿孔，患者也可有腹泻症状。另外视网膜病变是艾滋病患者的重要失明原因。除肺脏、胃肠道、视网膜外，肝脏和肾脏也常受累，而其他器官感染则相对少见。累及肝脏可致病毒性肝炎，并常与乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等重叠感染；累及肾脏可致肾小球肾炎，既可由病毒感染直接引起，也可由抗原抗体复合物免疫造成。

（5）HCMV感染与其他疾病
    ①HCMV感染与病毒性肝炎：研究显示在乙型肝炎患者中，HCMV DNA以及抗体阳性率显著高于健康人群，慢性轻度肝炎、慢性中度肝炎、慢性重度肝炎患者HCMV感染阳性率呈上升趋势。HCMV与肝炎病毒重叠感染，使患者细胞免疫功能进一步受损。原因可以解释为严重乙型肝炎患者机体免疫功能处于抑制状态，从而导致潜伏的HCMV被激活，进一步抑制细胞免疫功能，可能使乙型肝炎患者病情加重或迁延不愈。
    ②HCMV感染与原发性高血压及动脉粥样硬化：近年来研究显示原发性高血压患者存在较高的活动性HCMV感染，HCMV活动性感染与血管并发症有一定关联；HCMV感染与动脉粥样硬化具有一定相关性，患者的HCMV感染后可在动脉平滑肌细胞和血管内皮细胞内复制刺激动脉平滑肌增生，导致细胞内皮受损，加速动脉粥样硬化的进程。
    ③HCMV感染与呼吸系统疾病：研究提示肺癌患者HCMV DNA和血清HCMV IgM抗体阳性率明显高于非肺癌患者，小细胞肺癌合并HCMV感染者，病毒血症发生率高，病情凶险；HCMV感染也可加剧急性呼吸道感染患者的病情，损伤细胞免疫功能，增加混合感染的机会；另外临床资料显示慢性阻塞性肺病患者细胞免疫功能低下也可导致HCMV易感和激活，使病情反复发作并发感染。
    ④HCMV感染与肿瘤：资料显示HCMV与宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌、Kaposi肉瘤、成纤维细胞癌、Wilm肿瘤及结肠癌等肿瘤的发生有关。HCMV引起肿瘤发生可能通过以下过程：激活细胞并使之转化；诱使细胞染色体畸变；激活细胞癌基因。
    ⑤HCMV感染与性传播疾病：由于接触是HCMV的重要传播途径，HCMV感染可通过性接触而传播。

       实验室检查

1．一般实验室检查
    （1）临床血、尿、便检查：外周血常规检测可见白细胞数目减少或正常（少数出现白细胞增多）、血小板减少、淋巴细胞相对或绝对增高，异常淋巴细胞增多等。尿、便常规没有特异性提示，但当HCMV病毒感染累及肾脏致肾小球肾炎时可出现尿常规相应改变，或累及胃肠道时可出现腹泻、便血等致的大便改变。
    （2）生化检测：当HCMV感染累及肝脏时，可出现肝炎所致的酶学改变，包括肝功能异常、黄疸变化；累及肾脏可出现肾功能下降。
    （3）一般免疫项目：可出现冷球蛋白、类风湿因子以及抗核抗体等一过性阳性，但嗜异凝聚试验多为阴性。

2．细胞组织病理学检查　传统实验室检测法多采用尿液或唾液等，离心沉淀后涂片，也可取材于外科活检或尸检组织，以Giemsa或Papanicolaou染色后镜检细胞病变，观察有无巨细胞包涵体。此方法比较简便、快速，但无病原学的特异性，无法与其他疱疹病毒感染区别，特异性差，同时存在假阴性，如查不到巨细胞包涵体也不能排除诊断，可能是由于受感染者是间歇性地排出巨细胞，故需要多次检查。此方法易受药物治疗的影响，不能进行早期诊断。目前把组织病理学和DNA探针、荧光标记单抗结合起来检测巨细胞包涵体，使检测的敏感性提高。

3．病原学相关检测　HCMV感染的确诊有赖于HCMV的检出，从病毒分离、培养到血清免疫学检测、抗原检测，直到近年来发展起来的分子生物学检测，为HCMV感染的确定以及治疗监测提供了越来越准确的实验室依据。
    （1）病毒的分离和培养：HCMV不易在实验动物中生长，但易于在人成纤维细胞（HEL）培养基中生长。从临床标本中分离到一定量的病毒，被认为是检测HCMV感染最准确的方法，是传统意义上的金标准，但也受到了核酸检测等更敏感的新方法的质疑。分为两种方法：传统的病毒分离及快速细胞培养。由于HCMV增殖很慢，传统的病毒分离费时（需2～4周才能观察到细胞病变），费力，实验室设备及技术要求条件高，故不适于作为早期检测技术；在传统的细胞培养基础上发展起来的快速细胞培养是将快速组织培养与免疫荧光技术结合，把HEL培养于96孔微孔板中，并向其中加入处理过的单克隆抗体，标本接种后3d即检出结果。该方法适合大量临床标本的检测。但总的来说病毒分离培养对技术要求高，分离时间长，易污染，只有在条件较好的实验室开展，对于潜伏期及经药物治疗后的标本，病毒分离常为阴性结果，不适于作为早期诊断及药物治疗监测的检查手段。

（2）电镜检查：直接使用电子显微镜对标本中的病毒颗粒进行观察，但由于技术要求高、设备昂贵，不适于临床常规检验，多在科研工作中使用。

（3）血清学抗体检测：检测人感染HCMV后所产生的特异性抗体，包括IgG、IgM和IgA。IgA应用较少，IgM型抗体的检测被作为活动性感染的诊断指标，但当患者处于免疫抑制状态时，有时难以产生可以检测到的抗体，故不能作为器官、骨髓移植受者等患者HCMV活动性感染的检测指标；IgG型抗体阳性，表示既往感染，是病毒在体内潜伏的标志，潜伏感染状态被激发后IgG抗体滴度升高，当双份血清中IgG抗体阳转或滴度升高4倍或以上者则提示HCMV活动性感染。HCMV抗体多在病毒抗原血症后2周左右出现，虽无法提供现症感染资料（尤其是免疫低下患者），但由于其操作简便、快速，目前仍被临床应用，主要进行感染后的确诊、流行病学调查、孕前和孕早期筛查、器官移植的供者和受者术前筛查以及血液制品的检测。常用实验室方法包括以下几种，其中酶联免疫吸附试验应用较多。

①酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）：以免疫学为基础，将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高敏感催化作用相结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断结果。可经酶标测定仪做定量分析，敏感度可达ng水平。此方法既可用于抗体检测，也可用于抗原检测。ELISA用于HCMV抗体的检测时，可用HCMV免疫原性蛋白（如基质磷蛋白pp150与pp65，DNA结合蛋白（p52），pp38，糖蛋白gB和gH等）或多个抗原的重组蛋白和（或）多肽作为抗原包被微孔板，加待测血清（抗体），孵育后加相应酶标记抗体生成复合物，再与此酶的底物反应生成有色产物，检测HCMV IgG或IgM抗体。实验过程要设立阳性、阴性对照，适当稀释标本，避免假阳性（如类风湿因子的影响）或假阴性的出现。也可用捕获ELISA方法：抗人IgM链包被固相载体+被检血清+特异性抗原+酶标记特异性单克隆抗体+底物液显色。该方法可以避免类风湿因子等的干扰，使结果更加利于判定。

②补体结合试验（CF）：用于此法的抗原大多数从感染HC-MV实验株细胞中提取，检查的是抗HCMV感染的IgG抗体，由于抗体出现较晚，不适用于感染的早期诊断。与疱疹病毒属的其他病毒无交叉反应，是HCMV特异的，各HCMV病毒株都具有共同的抗原，CF法敏感性很低，因而目前不再应用。

③免疫印迹法（western印迹）：将高分辨的凝胶电泳和高灵敏度的免疫固相检出两种方法相结合，凝胶电泳使混合在一起的成分分开，通过敏感的生物分子亲和技术测定，克服了补体结合试验敏感性差，而较ELISA法具有更高的特异性，16h左右可作出诊断，快速简便。

④间接血凝试验或乳胶凝集法（HIA）：乳胶凝集法测定HCMV抗体是筛选血制品、器官供体的快速检测方法，几分钟内即可出结果。但由于判定结果时具有主观性，故存在一定误差，误差范围5％～20％（包括假阴性和假阳性）。

⑤免疫荧光技术（immunofluorescence assay，IFA）或放射免疫测定试验（RIA）：这两种方法的特点是用荧光素（或放射素）标记抗体或抗原，将血清学的特异性、荧光素（放射素）的敏感性及显微技术的高度精确性结合在一起。既可利用抗HCMV早期抗原的抗体，检测组织细胞中HCMV病毒早期抗原，也可以抗原检测抗HCMV抗体。由于没有放射污染问题，临床应用较多的是IFA。与病毒学检测相比，它的敏感性为93％，特异性为94.4％。具有快速、敏感、特异性高的特点，缺点是：需要昂贵的荧光显微镜；对标本要求高，要求尽可能地保持抗原形态，并保持在原有位置不溶解、不变性、不扩散或不移位；由于荧光强度受pH和荧光染料比例的影响，以及杂质的污染会影响结果，具有一定的主观性；标本不易长期保存；可产生假阳性，如与血清中的类风湿因子或嗜异性抗体均可产生假阳性。

（4）抗原检测：HCMV抗原的检测主要是应用单克隆抗体与特异性抗原结合的原理，借免疫组化染色技术手段检测出受检材料中的HCMV抗原。目前应用较多的是抗原血症的检测以及应用流式细胞仪检测HCMV抗原。

①抗原血症的检测：机体在感染HCMV后，可在外周血多核白细胞（PBLs）中检测到HCMV抗原，称为CMV抗原血症。目前主要是针对即刻早期抗原（IEA）、早期抗原（EA）和晚期抗原（LA）进行检测，最常被检测的抗原是pp65，病毒的被膜蛋白，由位于CMV衣壳和包膜之间的磷酸化蛋白构成，占病毒蛋白的15％，是CMV基因UL83编码的561个氨基酸的产物，是HCMV活动性感染的早期标志性产物。具体检测步骤包括：外周血白细胞的分离、玻片制备及固定细胞；加入特异性单克隆抗体的；加入酶或荧光素标记的二抗；最后应用显微镜观察阳性细胞数。相比辣根过氧化物酶标记抗体，应用免疫荧光素具有更高的敏感性。国外市场上已有检测pp65的商品试剂盒出售，并通过美国FDA注册认证。应用pp65进行抗原血症的检测是诊断急性HCMV感染的直接方法，它的优点是：可进行早期诊断，一般在临床症状出现前几天即可观察到阳性结果；具有较高的敏感性和特异性；比细胞培养快速、敏感；可以做到对病毒载量的半定量，阳性细胞数与临床症状的严重程度具正相关性。可用于早期诊断、抗病毒药物治疗监测以及预后评价。但是抗原血症检测方法也存在一定的缺点，如实验操作虽然比病毒培养方法简便，但也比较繁琐，需要有经验的操作人员进行，且结果判定存在主观因素；只能做到半定量，实验结果受到患者外周血白细胞数量的影响，细胞数量少则影响结果，如在骨髓移植术后早期的患者不适于使用此方法，而对实体器官移植受者影响不大；敏感性比核酸扩增差，对于微量的病毒抗原难以检测，所以应用核酸扩增检测则可以避免上述的不足之处，而被越来越广泛地应用于临床检测。

②流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测HCMV抗原：流式细胞技术是结合近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆抗体技术、激光技术、电子计算机技术等学科高度发展的结晶，具有检测客观、分析细胞数量大、参数多、统计结论可靠等特点，而被广泛应用于免疫基础研究及临床应用等多个方面。流式细胞技术与免疫组化染色相结合可以进行HCMV抗原的检测和定量，可以检测受感染细胞表面及细胞内的病毒抗原。常用的有直接和间接荧光抗体技术，直接法即用荧光素直接标记特异性单克隆抗体，而间接法是用未标记的一抗与受感染细胞的抗原结合，然后再将荧光标记的二抗与一抗结合。由于不同的抗体可以标记不同的荧光素，所以FCM可同时检测到同一种样本中的多种病毒或病毒抗原，同时获得多个分析参数。相比抗原血症检测，FCM可以检测的标本除血液外，还适用于支气管肺泡灌洗液、尿标本以及经酶消化过的组织细胞等多种标本；相比PCR方法，FCM可以确定病毒抗原的检出与细胞是否受到感染之间的关联。FCM可以应用于病毒感染的早期诊断，操作简单，客观，容易标准化，比传统的免疫组织化学更加敏感，但是缺点是设备昂贵，实验成本较高，在一般临床实验室难以普及。

（5）核酸检测：随着近年来分子生物学的迅速发展，目前HCMV感染的诊断技术已从生物学病毒分离和免疫学检测抗原抗体，进入到对基因组进行诊断的分子生物学水平阶段，其方法也被广泛地应用到HCMV的核酸检测中，如核酸杂交、PCR等，为临床提供了一个比上述其他方法更敏感、更特异的检测HCMV感染的方法。

①核酸杂交：主要有斑点杂交试验和原位杂交试验。斑点杂交实验是将从标本中提取的DNA，变性后点样到醋酸纤维素膜上，与带有放射性或荧光素标记的特异性的探针杂交后进行检测，应用荧光素标记具有较高的敏感性，同时避免了放射性污染，但斑点杂交的缺点是不能观察受感染细胞的状态。而原位杂交试验弥补了这一缺点，在保持细胞和组织的原有形态下，在细胞中定位检测特异的HCMV核酸的分布、数量、表达形式及其与细胞分化、病理生理状态、形态演变之间的关系。由于杂交试验检测的是核酸，DNA链的性状十分稳定的，而抗原分子是蛋白质在操作过程中，热作用、固定剂、包埋剂等均可造成蛋白质变性而影响检测效果，所以核酸杂交比检测抗原受外界的影响要小。核酸杂交技术具有快速、操作简便、特异性强、形态学定位好、敏感性高、探针稳定性高等优点，因而在疾病诊断中发挥越来越重要的作用。原位杂交可用以检测HCMV的DNA或mRNA，探针可用cDNA探针、反义（anti-sense）RNA探针、寡核苷酸探针。检测病毒mRNA可在活动性感染前2～3周即为阳性，早于抗原血症的检出，可早期诊断HCMV活动性感染。但由于mRNA量常受到待检标本固定等因素的影响，降低了原位杂交法检测的灵敏度，其检出率限于每个感染细胞内HCMV核酸的拷贝数不少于10～20个，而PCR理论上可检测出1个拷贝，另外杂交实验相对繁琐、费用高，在临床上应用并不广泛，多用于基础研究工作。

②PCR：由于PCR方法的高敏感性、高特异性、操作简便快速等优点，目前已被临床广泛应用，罗氏（Roche）公司具有获FDA批准的商品化试剂盒出售。PCR在用于监测免疫抑制病人的HCMV感染时，其敏感性高于病毒分离和抗原血症检测。检测时所要求的标本量很小，只需5μl的临床尿样标本和血液标本。外周血中的白细胞或血浆、血清均可用于HCMV PCR的检测，由于可以避免患者白细胞数量对试验的影响以及白细胞阳性可能为潜伏感染造成的假阳性，目前越来越多使用血浆和血清，但观点不尽一致：Nolte等认为检测血浆比白细胞更早期、敏感；而有其他文献显示血浆的敏感性差于白细胞，并在后期会转为阳性；Jabs等的监测显示用血浆和白细胞没有显著差异。PCR阴性对HCMV疾病排除率高，但由于PCR的高敏感性使其阳性预测值（PCR阳性者发展为有症状的CMV感染的患者数）很低。定性PCR扩增后的产物需电泳检测，具有溴化乙啶致癌物的危险，同时易造成交叉污染以及产物对模板的污染而出现假阳性，临床上正逐渐被荧光实时定量PCR所替代。

③实时荧光PCR（real time PCR）：1996年，美国Applied Biosystems公司发展了实时荧光定量PCR技术，对HCMV DNA的检测具有重大临床应用价值，有助于感染的早期诊断。定量PCR技术在一定程度上可以反应有和（或）无症状的病毒拷贝情况，在抗病毒治疗的药物监测和预防等方面也具有重要的意义。为了提高PCR的阳性预测值，同时在治疗方面为了减少药物的毒副作用、节约医药资源，可以在监测CMV DNA载量的变化，发现上升时再及时治疗（文献提示与移植后预防性给予抗病毒治疗在效果上未见显著差异），所以寻找一个合适的病毒载量阈值显得异常重要，但是目前尚无明确定义。国外研究显示大于5×103具有较高的患巨细胞病毒病的风险。

④反转录PCR（RT-PCR）：由于DNA并不是病毒复制的标志，故血HCMV-DNA阳性并不能说明有无活动性感染，所以检测病毒mRNA具有更高的特异性，具有较高的阳性预测值，而且比检测DNA可以提前1～4周获得阳性结果。但是操作上相对DNA PCR繁琐，对标本的采集和保存、提取具有“定限制，所以临床应用尚不如DNA PCR普及。
    关于在PCR检测HCMV感染以下问题值得注意。在PCR实验中选择引物是至关重要的，CMV基因的多变性使得引物与靶序列的不匹配造成PCR失败，单用一对PCR引物可引起假阴性，主要原因可能是临床标本中HCMV毒株的不同或病毒基因组中极微小变异（病毒拷贝数太低）所致。此外，即使引物设计所选的序列针对HCMV同一基因的不同部位，其PCR扩增结果也有明显差异。用针对不同基因的两对引物进行PCR可能避免假阴性产生。此外用巢式PCR也可提高检测的敏感性和特异性，应用一次同时扩增出多个核酸片段的多重PCR可以提高检测的敏感性。目前文献报道较多应用于检测的HCMV基因有：即刻早期（IE区）或主要即刻早期（MIE）基因区、DNA酶基因区、糖蛋白B（gB）、糖蛋白H（gH）基因区等。应用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法将gB分为4个基因型，gH分为2个基因型。gB的基因分型可能对预测HCMV感染的临床预后具有应用价值。虽有报道gBl型多感染免疫正常者，而gB2～4型多感染BMT患者及HIV感染者，但由于临床例数所限，并未形成定论。而且CMVgB基因或者mtrⅡ区基因（ORF79）等的突变不一定均引起功能上的改变，基因变异也与地区因素有关，所以均有待进一步研究与发现。所以国内外研究学者竭力探索特异、敏感的HCMV基因序列及其与致病性的相关性。目前HCMV株与致病性间的联系是未知的，不同HCMV基因序列变异也所知甚少。在我国目前用于PCR扩增的引物序列均取自于国外HCMV毒株，主要取自Towne和Adl69株，这两种毒株的DNA序列与我国流行的HCMV序列有无差异及这种差异是否影响PCR扩增的特异性和敏感性，尚无结论性的研究报道。因此必须进行深入探讨，建立一种适合我国国情和HCMV流行检测的PCR方法。

⑤芯片技术：以检测目的不同，可分为基因芯片技术和蛋白质芯片技术。基因芯片是指将大量已知DNA序列的探针固定于某种固相载体表面，形成致密、有序的DNA分子点阵。加入一次实验样本就可以一次性获得大量的数据并进行平行分析，文献报道可用HCMV基因芯片检测分析了HCMV基因在CD+34细胞中的表达过程，也可利用DNA芯片对HCMV感染宿主引起的细胞基因改变进行分析。但是此新兴技术，其成本高，技术上也存在一定难度，如一个芯片上的多个探针的最适杂交条件难以达到一致、实验中混入杂质使杂交背景增高等，目前难以在临床推广。蛋白质芯片是继基因芯片后发展起来的，基本原理是将大量蛋白质有规则地固定在介质载体上，利用蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用，达到检测蛋白质的目的。基本实验过程包括：首先将抗原点印在特制载体上，然后将待测血清标本与该芯片进行孵育反应，再将荧光标记的二抗与芯片抗原—抗体复合物反应，然后用聚焦显微镜对荧光信号进行检测。此方法可适用于抗原血症的检测，但是目前还尚未在临床广泛应用，随着技术的日益完善，相信会有广阔的临床应用价值。

       鉴别诊断

先天性，HCMV感染应与其他病原微生物（如风疹病毒、弓形虫、单纯疱疹病毒等）造成的先天感染及新生儿败血症进行鉴别；后天获得性感染应与EB病毒所致的传染性单核细胞增多症、病毒性肝炎、肺炎等鉴别。在接受骨髓移植患者中出现的肺炎及胃肠道症状等，应与移植物抗宿主病进行鉴别；在免疫低下患者出现的HCMV感染应与其他微生物引起的感染进行鉴别。

    【治疗概述】

治疗原则主要包括：抗病毒治疗、增强免疫力、应用激素以及对症支持治疗。
    （1）过去常用的抗HCMV感染药物有氟去氧尿苷、碘去氧尿苷、阿糖胞苷、阿糖腺苷和阿昔洛韦（无环鸟苷）等，但由于HCMV对上述药物敏感性并不很高加之其毒性作用非常大，目前多被下列抗HCMV感染药物所替代：更昔洛韦（ganciclovir）、膦甲酸（foscarnet）和cidofovir，三者均是通过抑制病毒的DNA聚合酶来抑制病毒DNA合成的。更昔洛韦是脱氧鸟苷的类似物，它必须被磷酸化生成三磷酸更昔洛韦才有抗病毒活性，HCMV的UL97基因编码病毒的蛋白激酶可以磷酸化更昔洛韦为一磷酸更昔洛韦，后两步的磷酸化由细胞内的激酶完成，三磷酸更昔洛韦是三磷酸鸟苷酸（HCMV2DNA聚合酶天然底物）的竞争性抑制药，三磷酸更昔洛韦的掺入可导致病毒DNA合成的减慢和最终停止。膦甲酸是焦磷酸的类似物，它非竞争抑制DNA聚合酶，不需要细胞内激活也不掺入病毒DNA链的合成，膦甲酸封闭DNA聚合酶对焦磷酸的结合位点，抑制三磷酸核苷酸裂解生成焦磷酸。Cidofovir是无环胞苷类似物，它也需要磷酸化才有抗病毒活性，但此过程由宿主的激酶完成，不依赖于病毒编码的激酶，二磷酸cidofovir是HCMV-DNA聚合酶的竞争性抑制剂，导致DNA合成减慢甚至停止。临床应用更昔洛韦较多，但由于只是暂时抑制病毒复制和阻止淋巴细胞繁殖，治疗后复发率高，故抗病毒疗程要长，停止静脉用药后口服更昔洛韦或阿昔洛韦3个月可减少复发。应用免疫抑制剂的患者长期使用更昔洛韦，可产生对更昔洛韦的耐药，主要原因是由于UL97基因发生改变，导致病毒编码的激酶与更昔洛韦的结合部位发生改变而不能对其完成磷酸化过程。但对更昔洛韦耐药的病毒对膦甲酸敏感。及早使用抗病毒药物，可以早期控制HCMV感染。一旦进入巨细胞病毒病期，药物治疗往往失败，所以要做到早诊断、早用药，同时监测这些药物的骨髓抑制、降低血象、严重肝、肾损害等毒副作用。
    （2）抗病毒的同时，需要增强患者免疫功能，如果可能，应减量或停止免疫抑制药。使用免疫增强药如转移因子、胸腺素或干扰素等可能具有一定效果。
    （3）应用糖皮质激素可以减轻病毒血症的症状，有利于退热，对肺炎患者可以减少肺部渗出。
    （4）对免疫功能低下的患者同时要注意预防和治疗细菌和真菌造成的感染，在骨髓移植患者中感染占死亡原因的首位。
    （5）对症和支持治疗同样重要，提高机体抵抗力，可结合中医药治疗。

    【预防】

在预防方面，由于HCMV感染非常普遍，所以预防其传播较为困难，但也应尽量减少其传播途径，如对患者隔离，并对其排泄物要消毒处理。对于易感人群，如器官移植受者、大剂量免疫抑制剂应用者、肿瘤患者以及AIDS患者等，应定期监测HCMV感染状况。增加对血液制品的HCMV筛查，尤其对血清阴性的受血者特别是新生儿或婴儿应筛选血清阴性的血液。孕妇患原发感染，孕早期应终止妊娠。孕妇如是复发或再感染，可继续妊娠，但需监测宫内是否存在感染以及胎儿发育情况。
    由于目前尚无抗HCMV感染的特效药，加之现有抗病毒药物的毒性作用及耐药的出现，所以疫苗研制具有广泛的应用前景。疫苗免疫使人体产生抗HCMV感染的特异性抗体。在20世纪60、70年代曾报道HCMV减毒活疫苗能使机体产生抗HCMV的特异性免疫，但英国学者经研究指出HCMV减毒活疫苗作用有限，特异性免疫维持时间较短。近年来提出使用HCMV亚单位疫苗以及DNA疫苗预防HCMV感染，研究显示DNA疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效力，但其有效性与安全性仍需进一步的确认。

（好医生网）

（吴娜）