神经系统相关蛋白的研究进展

邓文龙

神经系统相关蛋白的研究进展


[ 10-09-12 15:53:00 ]   


作者：栾永昕 张剑涛 付双林


【关键词】  神经系统相关蛋白;GAP43;p38

特异性蛋白在神经系统的再发育或再生中能够决定和诱导神经突起沿正确方向生长。有两类蛋白较为重要，一类能够在神经损伤后诱导促进神经突起生长;另外一类能够指引神经突起的延伸方向。很多特异性蛋白已经进入到研究者视野，其中包括GAP43、p38、L1黏附分子、外周髓鞘蛋白22等。本文将着重探讨GAP43与p38的变化与意义。

　　1 生长相关蛋白GAP43

　　20世纪80年代初，Skene等人发现了一种富含于生长锥中的神经组织特异性磷酸蛋白质，将其命名为生长相关蛋白(growthassociated protein 43，GAP43)。GAP43在神经纤维的生长、发育、轴突再生以及突触功能的维持等方面起着重要作用，并参与神经递质释放的调节，被认为是神经元发育和再生的一个内在决定因子〔1〕。

　　1.1 GAP43的结构及生化特性 GAP43又名B50、F1、pp46、神经调节素，含有226～243个氨基酸，只1个芳香族氨基酸残基，但丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Lys)和脯氨酸(Pro)的含量极丰富。其等电点4.3～4.5。不同种属间GAP43的分子量有微小差别，大鼠GAP43的分子量为23.6 kD，人类GAP43的分子量为24.8 kD〔2〕，编码GAP43蛋白的基因位于人的第3染色体，在大鼠中位于第16染色体，人和大鼠的GAP43基因均为单拷贝，包括2个启动子和3个外显子，第1个外显子编码第1～10位氨基酸，包括蛋白的膜结合域和G0、Gia1活性域。第2个外显子编码的氨基酸包括蛋白激酶C(PKC)的特异性磷酸化位点Ser41和其他的磷酸化位点以及与钙调素(CaM)结合的“IQ区域”;GAP43通过N末端的Cys3Cys4的棕榈酰化与膜连接。第3个外显子编码蛋白的羧基末端，其中包括一个Fmotif,猜测其可能与细胞骨架成分相互作用〔3，4〕。根据克隆到的大鼠、小鼠、牛以及人等的cDNA序列，不同物种GAP43一级结构具有高度的同源性，活性位点基本一致，氨基末端的短水解区是与膜的结合位点，第41位丝氨酸是PKC催化的磷酸化作用活性位点，第43～51位氨基酸构成与CaM的结合位点。

　　GAP43是神经特异性的CaM连接蛋白，是PKC特异性的底物之一，其磷酸化主要由βⅡPKC调控,磷酸化发生在其第41位丝氨酸残基上〔5〕。其二级结构以无规则卷曲为主，整个分子呈棒状，具有很强的柔性。GAP43具有高亲水性并可能通过与膜脂肪酸共价连接而与神经元膜结合，在突触前膜和生长锥的动态结构中含量极高，胞浆中含量极低，所以GAP43可能从生长锥或突触膜表面伸展开来，一方面与胞质及细胞结构蛋白相互作用，另一方面可逆的附着在膜表面〔2〕。

　　1.2 GAP43的分布及表达 GAP43在脊椎动物非神经组织很少表达，所以被认为是神经系统特异性蛋白。它广泛存在于大脑、小脑、脊髓以及自主神经系统的神经元内，在生长、分化和再生的轴突末端以及突触前膜含量极高。在发育中的神经元沿整个轴突表达，在生长锥表达尤其丰富，在哺乳动物中枢神经系统早期发育过程中有大量的轴突生长及突触形成，此时存在着高水平GAP43的合成及随轴浆的运输，随着神经元的发育成熟和突触联系的建立,其合成及运输明显下降。正常成年大鼠脑内许多区域有GAP43免疫组化反应阳性物，在成熟神经系统分布于某些特定区域的神经终末中，在神经胶质细胞中也有表达〔6，7〕。在中枢神经系统，阳性物弥散分布于皮质中〔8〕，在边缘系统和联合区，包括与突触可塑性相关的一些区域如海马和嗅球，GAP43呈持续高水平表达〔9〕。成人脑中GAP43 mRNA在联络区水平较高，其他区域和皮质下区都很低〔5〕。

　　1.3 GAP43的生理作用及作用机制

　　1.3.1 生理作用 GAP43及其mRNA在神经系统的表达分布特点表明它对神经发育和可塑性可能有重要作用，在发育和再生中轴突延长和突触形成整个时期表达都增加〔10〕。其作为神经元特异性的突触前膜蛋白，通过磷酸化去磷酸化、棕榈酰化去棕榈酰化调节、引导轴突生长和调节新连接形成而影响轴突生长能力，即使在缺乏其他营养因子时也能使神经元发出新的终末,并调节突触延伸和可塑性，以及神经递质的释放，所以GAP43被认为是神经元生长期的内在决定因子，可作为神经再生的标志〔6〕。转基因鼠的实验显示编码GAP43的外来基因的高水平过量表达可引起异常连接的自发形成〔11〕,表明高水平的GAP43可能与神经元的再生修复具有密切的关系。

　　1.3.2 作用机制 关于GAP43的作用机制不十分明确，目前的研究主要集中在以下四点〔12〕：(1)GAP43与膜骨架的关系及膜连接作用。GAP43最初在高尔基器内与神经元膜成分结合，最后多聚集于轴突突触前终末，然后通过其N末端的疏水性片段紧密连接在神经终末质膜胞质面，质膜内表面的蛋白网状结构可决定轴突终末的形状、活动性和通路引导。在生长锥，GAP43通过与组成网状结构的膜骨架蛋白如肌动蛋白、胞影蛋白等结合而影响突触前终末的生长状态〔13〕。 (2)GAP43与CaM的关系。GAP43是钙激活蛋白家庭的一员，含有一个“IQ”基序，可调节Ca2+流量及效力〔14〕。GAP43作为一个位于生长锥和突触前末端中的CaM结合蛋白，在正常情况下，GAP43与CaM结合，将CaM隔离于神经元膜区域，这种结合受到GAP43磷酸化过程中的产物磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2)的负调控。同时，GAP43与CaM的亲和性也是Ca2+浓度依赖的:当Ca2+低水平时，GAP43与CaM紧密结合，当Ca2+进入细胞后水平增高时便解离释放CaM，同时GAP43磷酸化，活化的GAP43进一步与细胞骨架成分相互作用，调节神经末端活力，进而改变细胞形态〔6，10〕。(3)磷酸化和去磷酸化。基因鼠过表达假磷酸化蛋白(将GAP43的磷酸化位点Ser41用另一带电氨基酸取代来模仿磷酸化)能诱导伪足生长、细胞黏附和肌动蛋白重组，使海马中产生大量投射纤维;反之，过表达去磷酸化GAP43 的转基因鼠的细胞出芽就大为减少。这表明，GAP43在Ser41的磷酸化可促进细胞的生长和出芽〔12〕。(4)在信号传递中的作用。GAP43在磷脂代谢和Ca2+信号传递中也起了重要作用。在第二信使系统中，PIP2在磷脂酶C (PLC)催化下可水解产生甘油二酯(DAG)和三磷酸肌醇(IP3) ，DAG的主要作用是激活PKC，而IP3能诱发Ca2+由胞内Ca2+储池释放，提高胞浆中游离Ca2+的浓度。磷酸化GAP43能抑制纯化PIPPIP2激酶的活性，从而抑制PIP2产生，成为PKC和Ca2+代谢的反馈抑制剂。另外PKC可由非PIP2途径激活并使GAP43磷酸化而抑制IP3依赖的Ca2+代谢，使胞内Ca2+处于低浓度水平，这对Ca2+起第二信使作用至关重要〔6，10〕。

　　1.4 GAP43与神经系统疾病 近几年人们开始逐步认识到中枢神经系统具有高度的可塑性，正是由于存在这种可塑性，才使得损伤后脑组织能够通过结构重建、功能代偿以达到整体脑功能的恢复，在损伤后主要通过侧枝出芽和潜伏通路和突触启用两种形式进行结构的重塑以达到功能代偿〔15〕，GAP43因其特性在脑损伤中可能发挥的作用也逐渐得到重视。Luque等〔16〕的实验证明，大鼠脑皮质缺血再灌注后，缺血灶周围活神经元轴突末梢GAP43的表达水平升高。也有人观察大鼠癫痫所致脑损伤的各阶段均有GAP43水平的升高。这些实验结果表明GAP43可能为TBI后中枢神经系统可塑性损伤修复的重要物质。

　　2 突触素p38

　　突触素(synaptophysin) 是一种位于突触囊泡膜上的钙结合蛋白。1985年Jahn等首先在大鼠中发现，晚些时候德国肿瘤研究中心Wiedenmanm等在牛脑中发现并提纯了这种蛋白质，把它命名为synaptophysin，分子量38 kD，缩写为p38、SYP或SYN。

　　2.1 p38结构及生化特性 人类的p38基因包括七个外显子，大约20 kb,位于X染色体Xp11.22p11.23，而小鼠的p38基因位于X染色体的AD区〔17〕。突触素家族包括突触素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，其中突触素Ⅰ和Ⅱ均有a，b两种亚型，同属磷酸蛋白家族，均具神经特异性，突触素Ⅲ至少可有a～f6种亚型。各类突触素均包括A、B、C区，其不同则表现在D、E、F、G、H、I区。其中A区是一个短的氨基末端序列，可被Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶和蛋白激酶A磷酸化，且与突触囊泡磷脂结合;B区短链氨基酸较丰富(脯氨酸/丙氨酸/甘氨酸/丝氨酸);C区几乎由突触素中一半的序列组成。p38由307个氨基酸组成,分子量为38 kD，是突触囊泡膜上的特异性蛋白质，含量占突触囊泡膜蛋白的6%～8%，突触前膜含有大小两种突触囊泡:小清亮突触囊泡(small clear synaptic vesicles,SSV)和大致密核心囊泡(large dense cored vesicle,LDV)。p38广泛分布于SSV上，LDV内缺乏。p38包括4个跨膜区，其氨基端和羧基都暴露在胞浆内。第1个囊泡内环是糖基化的，而胞浆羧基末端是CAMK磷酸化的丝氨酸残基和pp60c_src磷酸化的酪氨酸残基〔18～20〕。突触素的羧基端可结合Ca2+，是突触囊泡钙结合蛋白之一，可被酪氨酸蛋白激酶磷酸化。SYN在进化上高度保守，通过比较牛、小鼠和人的SYN序列发现，只有囊泡内环的氨基酸序列有明显不同(22%)，而跨膜区和胞浆侧的序列则高度保守(只有3%的差异)〔21〕。

　　2.2 p38的分布及表达

　　2.2.1 P38在神经系统中的分布 Wiedenmann等〔19〕对小鼠、大鼠、牛及人的突触素研究发现，其在各种神经元的突触前囊泡中广泛存在，在神经系统中所有的神经末梢突触素均呈点状分布，而在白质及胶质细胞中没有突触素出现。舒先涛等〔22〕运用免疫组织化学方法结合图像分析研究突触素p38免疫反应产物在Wistar大鼠小脑皮质的分布及年龄变化，结果显示p38免疫反应产物呈板层分布模式，神经毡即神经突起构成的网状结构内免疫反应产物呈特征性颗粒状或点状，神经胞质淡染，神经胶质细胞、血管及白质不被染色。在分子层，颗粒样反应产物分布均匀，并映衬出树突分支的轮廓。在Purkinjes细胞层，深染的颗粒样产物排布在胞体周围。颗粒层中有丰富的不规则形球样结构,实际反映了组成小脑小球的苔藓样纤维终末和星形神经纤维终末。突触素在海马的神经毡区呈现颗粒状或点状免疫标记于神经元胞体，胶质细胞、白质及血管不被标记，海马、齿状回出现明显免疫标记板层分布，海马本部以多形层和辐射层染色较深，腔隙分子层次之，齿状回以分子层染色最深，并分为内、中、外带，内、外带较中带深染〔23〕。

　　2.2.2 p38在其他组织及细胞中的分布 Leclerc等〔24〕对p38的组织分布进行了研究，发现在大鼠前脑和小脑中有广泛分布，但是在肾上腺皮质、卵巢、唾液腺、骨髂肌、心肌、肾脏、肝脏仅有微弱的阳性反应。但Navone等在肾上腺髓质中却发现有很强的免疫反应。另外，在胰、胃、内分泌细胞、甲状腺细胞、PC12和CH4细胞系中也发现有p38存在。

　　2.3 p38的生理作用及作用机制

　　2.3.1 参与神经递质的释放及突触囊泡的循环 神经元受到刺激，产生神经冲动，传至突触前膜，引起突触前膜去极化，细胞外Ca2+内流，触发突触囊泡向突触前膜靠近和融合，引起突触囊泡释放神经递质。突触素的羧基端可结合Ca2+，同时也可被酪氨酸蛋白激酶磷酸化，对SSV的胞吐起重要作用。最近研究发现,在突触囊泡与质膜融合前，p38与另一膜蛋白synaptobrevin(VAMP)互相结合在一起，随着Ca2+内流，VAMP与p38分离，接着导致突触囊泡与质膜的融合。因此，p38+VAMP的多分子复合物参与囊泡导入和融合〔25〕。作为膜融合蛋白，p38能够形成六角形的缝管样的连接通道。在囊泡膜与质膜之间由P38形成的这种缝管样连接的融合孔，在Ca2+作用下迅速开启，释放递质后又可迅速关闭。应用黑寡妇蜘蛛毒提出αLTX，同时又使其缺Ca2+阻断囊泡膜再循环时,p38分布于除突触前膜以外的质膜上。当同样剂量的αLTX在给予Ca2+的条件下(不阻断膜再循环) ，p38又出现在囊泡膜上〔26〕。这也充分证实了p38参与突触囊泡与质膜的融合及囊泡膜的再循环。

　　2.3.2 参与突触的发育 在突触形成早期，突触囊泡均匀分布在轴突中。突触联系建立后，含神经递质的囊泡被分配到两个区域即储存区域和释放区域，释放区域囊泡定位到活性区域，可以进行释放。突触素如何参与突触连接的机制尚未明确，但实验证明，注射突触素I和突触素II的爪蟾胚胎的脊椎神经元，神经肌肉突触接头形态和功能的发育可被加速。突触素Ⅰ基因敲除小鼠出现突触末端变小及末端突触囊泡数量降低的现象。突触素Ⅰ、Ⅱ缺陷的海马神经元虽然可以形成突触连接，但突触数量较野生型的少，此外，突触素Ⅰ、Ⅱ基因缺失的神经元其突触形成时间比野生型晚1 w〔27〕。Ferreira等人利用反义寡核苷酸在突触形成之前对突触素II表达进行阻断，发现海马神经元突触的形成受到了抑制〔28〕。突触素Ⅰ、Ⅱ在突触联系形成过程中具有相似的作用，主要是直接参与突触形成及调节突触相关其他突触蛋白的表达，但其机制尚不完全清楚。研究证明神经母细胞和神经胶质细胞瘤中Ⅱb的过量表达会导致其他突触蛋白升高，包括突触素Ⅰ和突触泡蛋白〔29〕。

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　　2.3.3 参与调节神经原的延伸 Ferreira等〔30〕人通过实验发现，正在延伸的细胞结构中也有突触素的存在，表达区域包括小脑颗粒细胞生长锥，所有突触素成员都有上述表达现象以及亚细胞定位特点。不同的是突触素Ⅲ表达高度集中在海马神经元生长锥部位，且以发育早期表达量最高〔29〕。Clin等〔27〕的实验证明，敲除突触素Ⅰ基因的小鼠神经元发育时能够延伸神经元的突起，但是明显较野生型的短，而且缺乏轴突分支。在突触素Ⅱ基因敲除模型中，大部分细胞出现变形突起，不能延伸成轴突〔30〕。在突触素Ⅲ敲除模型中，可以观察到出现正常的小突起，但不能延伸，也不能分化成轴突〔31〕。以上结论都提示突触素在神经原的延伸过程中的不同阶段发挥了某种作用，但其作用机制并不明确。另外，突触素与细胞骨架之间的相互作用可能是神经元突起延伸的一方面原因，在未分化突起，微管的选择性稳定会导致突起选择性网状延伸，而突触素可能会在其中起到一定作用。当然，这些推测还需进一步实验证明。

　　2.4 p38与神经系统疾病 突触素磷酸化异常及其相关疾病突触素磷酸化状态异常可能与某些疾病的发生有关。Lievens等〔32〕发现表达亨廷氏病的R6/2转基因小鼠纹状体和大脑皮质突触素Ⅰ磷酸化状态异常：3～5位点早期过度磷酸化，而位点1没有改变，位点6只在接近疾病后期时才减少;而突触素蛋白水平并无改变。表明突触素磷酸化去磷酸化过程早期发生异常可能影响突触囊泡运送，导致亨廷氏病神经传递的缺陷。此外，Qin等〔33〕等人发现阿尔茨海默病患者海马分区域内突触素Ⅰ水平下降。这些研究均表明，突触素在突触连接的发生、发育过程中可能起到非常重要的作用。

【参考文献】
  　　1 Benowitz LI，Routtenberg A.GAP243：an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity〔J〕.Trends Neurosci，1997;20(2):84.

　　2 王红霞，吕国枫,刘 晶，等.神经生长相关蛋白GAP43与精神疾病〔J〕.中国神经精神疾病杂志，2006;32:934.

　　3 Oestreicher AB，De Graan PN，Gispen WH，et al.B50，the growthassociated protein 43：modulation of cell morphology and communication in the nervous system〔J〕.Prog Neurobiol，1997;53:627860.

　　4 Gajda M，Adriaensen D，Cichocki T.Development of the innervation of long bones：expression of the growthassociated protein 43〔J〕.Folia Histochem Cytobiol,2000;38:1034.

　　5 Qin H，Dent EW，Meiri KF.Modulation of actin filament behavior by GAP243 (neuromodulin) is dependent on the phosphorylation status of Ser41，the protein kinase C site〔J〕.J Neurosci，1997;17(10):3515.

　　6 严恒林.生长相关蛋白(GAP43) 与神经发育和再生〔J〕.神经解剖学杂志，1993;9(2):155.

　　7 Gamby C，Waage MC，Allen RG，et al.Growthassociated protein 43 (GAP43) facilitates peptide hormone secretion in mouse anterior pituitary AtT  20 cells〔J〕.J Biol Chem，1996;271 (17):10023.

　　8 管兴志，匡培根.脑缺血后生长相关蛋白43 基因表达变化〔J〕.国外医学脑血管疾病分册，2000;8(1):9.

　　9 Stewart HJ，Cowen T，Curtis R，et al.GAP43 immunoreactivity is widespread in the autonomic neurons and sensory neurons of the rat〔J〕. Neuroscience,1992;47(3):673.

　　10 Skene JH. Axonal growthassociated proteins〔J〕.Ann Rev Neurosci 1989;12:127.

　　11 Ludwig A，Silvia A，Josef PK,et al.Overexpression of the neural growthassociated protein GAP43 induces nerve sprouting in the adult nervous system of transgenic mice〔J〕.Cell，1995;83:269.

　　12 覃华丽,周 雪,章 为.生长相关蛋白GAP43 的研究现状〔J〕.四川解剖学杂志，2002;10(2):7883.

　　13 Larry IB，Aryeh R.GAP43：an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity〔J〕.TINS，1997;20 (2)：84.

　　14 Gerendasy D.Homeostatic tuning of Ca2+ signal transduction by members of the calpacitin protein family〔J〕.J Neurosci Res，1999;58(1):107.

　　15 Delisa JA.Rehabilitation medicine principle and practice 〔M〕.3rd ed.New York：LippincottRaven Publishing House，1998：106970.

　　16 Luque JM，Puign N，Martinez JM,et al.Glutamate Nmethy LDaspartate receptor blockade prevents induction of GAP43 after focal ischemia in rats〔J〕.Neurosci Lett，2001;305(2):8790.

　　17 Ozcelik T，Lafreniere RG，Archer BT,et al.Synaptophysin：structure of the human gene and assignment to the X chromosome in man and mouse〔J〕.Am J Hum Genet，1990;47(3):55161.

　　18 Baenekow A，Jahn R，Scheller M.Synaptophysin：A substrate for the protein tyrosine kinase pp60c_src in intact synaptic vesicles〔J〕. Oncogene,1990;5(6):101924.

　　19 Navone F，Jahn R，DiGioia G,et al.Protein p38：An integal membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells〔J〕.J Cell Biol，1986;103(6)：251127.

　　20 Leube RE，Kaiser P，Seiter A,et al.Synaptophysin：molecular organization and mRNA expression as detemined from cloned cDNA〔J〕.EMBO J,1987;6(11):32618.

　　21 Joheston PA，Jahn R，Sudhof TC.Transmembrane topography and evolutionary conservation of synaptophysin〔J〕.J Biol Chem，1989;264(2):126873.

　　22 舒先涛，张纯清，陈运才.大鼠小脑皮质内突触素p.38免疫反应产物的分布及年龄变化〔J〕.解剖学杂志，1997;20:414.

　　23 洪 岸,姚志斌,顾耀铭,等.老年大鼠学习记忆减退与海马结构的突触素改变〔J〕.解剖学报,1996;27(2):1648.

　　24 Leclerc N，Philip W，James W.Synap tophysin expression during synaptogenesis in the rat cerellar cortex〔J〕.J Comp Neurol，1989;280:197212.

　　25 Crispino M，Stone DJ，Wei M,et al.Variations of synaptotagmin I，synaptotamin Ⅳ,and synaptophysin mRNA levels in rat hippocampus during the estrous cycle〔J〕.Exp Neurol，1999;159(2):57483.

　　26 万选才,杨天祝,徐承焘.现代神经生物学〔M〕.北京:北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1998：5860.

　　27 Chin LS，Li L，Ferreira A,et al.Impairment of axonao development and of aynaptogenesis in hippocampal neurons of synapsin Ideficient mice〔J〕.Pro Natl Acad Sci USA，1995;92:92304.

　　28 Ferreira A，Han HQ，Greengard P，et al.Suppression of sunapsin Ⅱ inhibits the formation and maintenance of synapaes in hippocampal culture〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92:92259.

　　29 Ferreira A，Kao HT，Feng J,et al.Synapsin Ⅲ：developmental expression，subcellular localization and role in axonal elongation〔J〕.J Neurosci,2000;20:373644.

　　30 Ferreira A，Kosik KS，Greengard P,et al.Aberrant neunites and synaptic vesicle protein deficiency in synapsin Ⅱdepleted neurons〔J〕.Science，1994;264:9779.

　　31 Angers A，Fioravante D，Chin J,et al.Serotonin stimulates phosphorylation of aplysia synapsin and alters its subcellular distribution in sensory neurons〔J〕.J Neurosci，2002;22(13):541222.

　　32 Lievens JC，Woodman B，Mahal A,et al.Abnormal phosphorylation of synapsin I predicts a neuronal transmission impairment in the R6/2 Huntington′s disease transgenic mice〔J〕.Mol Cell Neurosci，2002;20(4)：63848.

　　33 Qin S，Hu XY，Xu H,et al.Regional alteration of synapsin I in the hippocampal formation of Alxheimer′s disease patients〔J〕.Acta Neuropathol (Berl)，2004;107(3)：20915.