美研究显示银杏提取物无减缓认知衰退功效

顾汉现

美研究显示银杏提取物无减缓认知衰退功效


发布时间：2009-12-30 15:07:11


美研究显示银杏提取物无减缓认知衰退功效


美国匹兹堡大学研究人员09-12月29日公布报告称，对老年人而言，服用银杏提取物补充剂似乎并不能减缓他们认知能力的自然衰退。

研究人员在2000年至2008年间对3069名年龄在72岁至96岁之间的老年人进行了平均为期6.1年的跟踪调查，其中1545人每日服用两次剂量为120毫克的银杏提取物，另外1524人则服用安慰剂。

研究人员发现，与服用安慰剂相比，服用银杏提取物未能减缓老年人整体认知能力以及记忆、语言、注意力、视觉空间能力及执行功能等特殊认知能力的下降。他们也没有发现年龄、性别、种族、教育程度对治疗效果产生影响的证据。

银杏提取物在欧美国家市场普遍销售，人们希望通过服用它预防、延迟或改善与老化及神经退行性病变等有关的认知功能损伤。

顾汉现

英国一研究置疑银杏提取物治疗痴呆症效果


发布时间：2008-6-17 13:57:14


英国一研究置疑银杏提取物治疗痴呆症效果


数十年来，多数研究人员一直认为银杏提取物对人体有许多益处，比如治疗痴呆症。但英国伦敦帝国理工学院的一项新研究提出异议，认为银杏提取物对治疗痴呆症没有效果。

研究人员对176名轻度和中度痴呆症患者进行了研究。患者被分成两组，一组服用银杏提取物，一组服用安慰剂。为期6个月的试验没有发现这两组患者的康复水平有任何差别。

具体试验方法是，服药组的患者每天服用120毫克的银杏提取物，然后每隔两个月评估所有患者的认知技能和生活质量情况。测试内容包括回忆单词或回答有关时间和地点的问题。研究人员没有发现有证据表明服用银杏提取物对记忆有好处。同时，根据患者本人或他们的看护者报告的情况，在整个研究过程中，服药组的患者生活质量也没有改观。

不过，其他专家指出，这次研究选取的患者人数较少，跟踪时间也不长。之前的多数研究结果都认为银杏提取物对提高痴呆症患者记忆力有益。目前，在英国有相当比例的痴呆症患者服用银杏提取物。

顾汉现

原研药银杏内酯B注射液完成三期临床


作者:  来源:金羊网-新快报  发布者: 吴林寰


日期: 2010-02-02  


总投资达1.4亿元研发的国家一类新药“银杏内酯B注射液”已经完成Ⅲ期临床试验，预计今年上半年可取得新药证书正式上市。该药是风行发展集团下属的广州市花城制药厂与中国人民解放军总医院、合肥工业大学共同研发拥有自主知识产权的国家新药。               



据介绍，银杏内酯B注射液是广东省重点创新项目程。银杏是我国特有的树种，自上世纪90年代起，银杏制剂一直是人们治疗脑血管疾病的首选天然药物。银杏内酯B单体对治疗心血管疾病、脑缺血、脑老化、老年痴呆症及哮喘有独特的疗效。然而，银杏内酯B提纯不易，工业化生产更难，我国将银杏叶作为药物研发起步比国外晚了二十多年。               



据专家介绍，中风是一组好发于中、老年人的急性脑血管病，其特点是发病率高、死亡率高、致残率高、并发症多等特点，因此又称“三高一多”症，是严重威胁人类健康的疾病。在WHO组织调查的57个国家中，死于脑血管疾病者占11.3%，我国死于脑血管疾病者多于心脏病及癌症，居三大死因之首。               



据了解，参加临床试验的包括辽宁中医药大学附属第二医院、广东省第二中医院、昆明医学院第二附属医院等十三家单位，总例数为1260例，实验显示：银杏内酯具有广泛的确切的药理作用，可改善脑血管循环，增加血流量，激活脑组织代谢，防止缺血缺氧及脑水肿，促进脑细胞功能恢复，改善周围动脉栓塞，促进神经功能恢复等作用。试验结果表明，该药可治疗缺血性脑病，包括急性缺血性中风脑梗塞。              （冬青  映平）      

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银杏黄酮苷元对内皮细胞植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1表达的影响


[ 10-02-06 09:44:00 ]  作者：何艳，付永昕，吴立荣，方颖，李安敏，陈云


【摘要】  目的： 探讨银杏黄酮苷元对氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)诱导脐静脉内皮细胞株ECV304植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1（Lectinlike oxidized low density lipoprotein receptor1，LOX1）表达的调节作用。方法： 应用逆转录聚合酶链式反应、SP免疫组织化学法，探讨oxLDL诱导下内皮细胞表达LOX1及银杏黄酮苷元的干预作用。结果： 6.25～25 mg/L银杏黄酮苷元与脐静脉内皮细胞株ECV304共同培养6～48 h可显著抑制oxLDL诱导的内皮细胞LOX1mRNA和蛋白表达（P<0.05），具有浓度、时间效应关系(P<0.05)；LOX1拮抗剂聚肌苷酸可抑制oxLDL诱导的内皮细胞LOX1mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论： oxLDL可能通过LOX1导致内皮功能障碍，银杏黄酮苷元可显著抑制oxLDL诱导的内皮细胞LOX1表达，这可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。

【关键词】  受体，LDL； 银杏； 黄酮类； 内皮，血管

　　［Abstract］ Objective: To investigate the regulating effects of ginkgetin aglycone (GA) on oxidized low density lipoprotein (oxLDL) induced gene and protein expression of lectinlike oxidized low density lipoprotein receptor1 (LOX1) in human umbilical vein endothelial cell line 304 (ECV304).Methods: RTPCR and SPimmunohistochemistry assay were used to detect the expression of LOX1 in endothelial cells under the induction of oxLDL and the intervention effect of GA. Results: The expression of LOX1 mRNA and its protein was inhibited significantly when ECV340 cells were incubated with 6.25～25 mg/L GA for 6～48 hours（P<0.05）, and to some extend, the inhibitory effect appeared dependant on the drug concentration and action time （P<0.05）. LOX1 receptor inhibitor, polyinosinic acid showed inhibition to the expression of LOX1 mRNA and protein induced by oxLDL (P<0.05). Conclusions: Endothelial dysfunction could be caused by oxLDL through LOX1, and GA can inhibit significantly the expression of oxLDL induced LOX1, which may be one of its antiatherosclerosis mechanisms.

　　［Key words］lipoprotein LDL recepters; Ginkgo biloba; flavones; endothelium,vascular
   
　　氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）导致内皮功能障碍在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）病理过程中起关键作用[1]，植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1（Lectinlike oxidized low density lipoprotein receptor1，LOX1）作为近期发现的主要在内皮细胞表达的oxLDL特异性受体，介导了oxLDL对内皮细胞的损伤作用[2]。银杏黄酮苷元（Ginkgetin Aglycone，GA）是通过酸水解-重结晶法去除单糖后获得的新型银杏叶提取物（Ginkgo Biloba Extract，GBE ），与传统GBE比较，GA具有较强的脂溶性和体内生物效价高的特点。目前，国内外对GBE防治动脉粥样硬化的实验研究和临床应用很多，但对GA的研究却很少。本研究在培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304上观察了不同浓度GA、作用不同时间对oxLDL所致的内皮细胞表面LOX1异常表达的干预，以期为GA进一步用于临床防治AS性疾病提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1．1  试剂及仪器

　　人脐静脉内皮细胞株ECV304（中国典型培养物保藏中心），氧化低密度脂蛋白（中山大学谢志忠博士提供），DMEM培养基（Gibco），聚肌苷酸(Polynosinic ，PIA，Sigma），新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），总RNA提取Trizol试剂及逆转录聚合酶链反应（Reverse transcriptionpolymerse chain reaction  RTPCR）试剂盒（北京天根生化科技有限公司）， LOX1兔抗人多克隆抗体（Sata Cruz）；染色体图像分析仪（Leica），梯度PCR仪（Eppendorf公司AG22331型），凝胶图像分析系统（Eppendorf公司AG22331型）；上海捷瑞生物工程有限公司合成下列引物。LOX1mRNA（193 bp）上游引物：TTA CTC TCC ATG GTG GTG CC，下游引物：AGC TTC TTC TGC TTG TTG CC；βactin mRNA(295 bp)上游引物：5TCA CCC ACA ATG TGC CCA TCT ACG A3，下游引物：5CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G3。银杏黄酮苷元（Ginkgetin Aglycone， GA）由贵州省生化中心何照范教授惠赠（主要成分：槲皮素25.75%、山奈酚15.26%、异鼠李素1.77%、总黄酮苷元占总成分含量42.79%），其它试剂均为分析纯。

　　1.2 人脐静脉内皮细胞株ECV304培养

　　人脐静脉内皮细胞株ECV304用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml硫酸链霉素的DMEM培养液培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，当细胞生长至80%融合以上时，用体积分数0.25%胰酶消化后，以1∶2或1∶3传代，传代后第2天换液1次，以后每2～3 d换1次液，约3～4 d可长成单层细胞。

　　1.3 实验分组

　　取对数生长期细胞，随机分为对照组（培养基）、oxLDL组（培养基中加入终浓度为50 mg/L的oxLDL后继续培养24 h）、银杏黄酮苷元浓度效应组（GA 6.25 mg/L、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L预先培养48 h，然后加入终浓度为50 mg/L的oxLDL培养24 h）、银杏黄酮苷元时间效应组（GA 25 mg/L预先分别作用6、12、24 h后，加入终浓度为50 mg/L的oxLDL培养24 h）和LOX1拮抗剂组（PIA250 mg/L预先作用2 h后，加入终浓度为50 mg/L的oxLDL培养24 h）。

　　1.4 形态学观察

　　相差显微镜观察各组内皮细胞形态变化。

　　1.5 LOX1mRNA测定

　　样品总RNA提取采用Trizol试剂盒，操作按试剂盒说明进行。A260/A280测定RNA浓度和纯度。采用二步法逆转录试剂盒，将RNA逆转录成cDNA作为模板进行扩增。PCR反应条件均为94 ℃预变形5 min，94 ℃变性30 s，55.4 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循环40次，最后72 ℃延伸10 min，反应终产物立即进行电泳跑胶，凝胶图像分析电泳结果并照相，测定各条带吸光度值。以恒定表达的βactin mRNA作为内参进行校正，计算相对表达量。实验重复3次。

　　1.6 LOX1蛋白表达

　　采用SP免疫组织化学法检测。 用特异性兔抗人LOX1多克隆抗体进行细胞免疫组织化学鉴定，以PBS代替一抗作阴性对照。显微镜下观察并计数，以胞浆和胞膜着色为棕黄或棕褐色颗粒为LOX1蛋白表达阳性细胞，计数阳性细胞数和染色强度累计积分，结果以均数表示。

　　1.7 统计学方法

　　采用SPSS 11.5统计学软件进行分析，数据以（x±s）表示，多组间比较进行方差齐性检验和单因素方差分析（oneway ANOVA），P<0.05表示差异具有显著性。

　　2 结果

　　2.1 人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞

　　与对照组比较，银杏黄酮苷元（≤50 mg/L）对ECV304生长无影响，细胞贴壁生长，黏附紧密，呈典型的铺路石样分布，细胞存活率均大于100%。

　　2.2 LOX1mRNA表达

　　与对照组比较，oxLDL 可明显上调LOX1 mRNA表达，差异显著（P<0.05）。用GA（6.25～50 mg/L）预处理48 h后，均可显著抑制oxLDL诱导内皮细胞LOX1 mRNA表达（P<0.05）；且此效应25 mg/L组>12.5 mg /L组> 6.25 mg/L组（P<0.05），提示此效应有一定浓度依赖性。见图1和图2。
     　　
　　25 mg/L GA预处理细胞6～24 h，均可显著抑制oxLDL诱导细胞LOX1mRNA表达（P<0.05）。药物效应24 h>12 h和6 h组（P<0.05），12 h和6 h组之间差异不显著（P>0.05），提示GA与细胞作用6 h后即可发挥抑制LOX1mRNA表达的作用，该作用在24 h时较强。用LOX1阻断剂PIA对细胞进行预处理2 h，可显著抑制oxLDL诱导的内皮细胞LOX1mRNA表达（P<0.05）。

　　2.3 银杏黄酮苷元对oxLDL诱导的内皮细胞LOX1蛋白表达的影响

　　结果（图3、表1）表明，经oxLDL作用后，内皮细胞LOX1蛋白被大量地诱导表达，与对照组相比，差异显著（P<0.05）。用GA 25 mg/L预处理48 h和LOX1受体阻断剂PIA 250 mg/L预处理2 h，均可完全阻断oxLDL诱导内皮细胞LOX1蛋白过量表达，与oxLDL组比较，P<0.05；与对照组比较，P>0.05。表1  GA对oxLDL诱导内皮细胞LOX1蛋白表达的影响（略）注：(1)与对照组比较，P<0.01 ；(2)与oxLDL组比较，P＜0.01。

　　3 讨论
     　　
　　在AS的形成过程中，oxLDL发挥着重要作用。oxLDL主要通过两种机制促进AS的进展，一是巨噬细胞通过清道夫受体摄入oxLDL，引起血管壁泡沫细胞的堆积和脂质的形成；二是oxLDL改变了内皮的多种功能，包括抑制内皮源性一氧化氮的释放、介导黏附因子的产生、改变与内皮凋亡图3  内皮细胞LOX1蛋白表达结果(SP,×400)
Fig.3  The immunohistochemistry results of LOX1 protein in different groups有关的基因，如bcl1、fas和一氧化氮合酶的表达等[3]。LOX1是一种新发现的oxLDL特异性受体，与已发现的oxLDL受体无同源性，与内皮损伤和功能失调有关。本研究显示，oxLDL可以上调内皮细胞表达LOX1，而LOX1的受体拮抗剂可以阻断oxLDL诱导的LOX1表达，提示LOX1不仅是oxLDL的特异性受体，oxLDL还通过LOX1途径上调LOX1mRNA和蛋白表达，从而增加对oxLDL的摄取及其后的内皮损伤效应。
     　　
　　GBE是目前国内应用较广泛的治疗心脑血管疾病的植物提取物，有效成分主要是黄酮和萜内酯，其中黄酮类包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素等，具有很强的清除氧自由基和抗脂质氧化作用。研究显示，银杏黄酮对心肌缺血再灌注引起的心肌顿抑及相关的室性心律失常、心功能障碍、心肌和血管内皮结构损害均有一定的保护作用[4]，增加内皮细胞增殖、抑制凋亡，促进血管内皮修复[5]；影响一氧化氮合酶表达，改善内皮功能；抑制同型半胱氨酸活化核因子-κB，调节AS炎症反应[6]。但是，GBE中的黄酮95%以黄酮糖苷的形式存在，在人体内代谢时不能通过小肠壁进入到血液，而是被肠腔微生物通过杂环裂解方式降解，从而降低口服利用率。本研究采用的GA系黄酮糖苷经酸水解-重结晶法去除糖链后获得的新型药物，增加了脂溶性和生物利用度，但目前国内外对GA的药理活性研究甚少。
     　　
　　本实验在培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304基础上，发现GA可以明显抑制oxLDL诱导的LOX1mRNA表达，并呈时间、浓度依赖性。免疫组织化学的结果也显示GA显著抑制oxLDL诱导的内皮细胞LOX1蛋白表达，提示GA在基因和蛋白水平均明显抑制oxLDL诱导的LOX1表达，这可能是其抗AS的机制之一。本研究通过体外实验证实GA可以减少oxLDL特异性受体LOX1的表达，揭示了GA可能的抗动脉粥样硬化机制，为GA这类特色药物更好应用于临床提供了实验依据。

【参考文献】
  　　[1]Vita JA，Keaney JF．Endothelial function :a barometer for cardiovascular risk[J]．Circulation，2002（106）: 640-642.

　　[2]Jawahar L，Mehta，Dayuan Li，et al．Identification,regulation and fuction of a novellectinlike oxidized lowdensity lipoprotein receptor[J]．J Am Coll Cardiol，2002（39）：1429-1435.

　　[3]Mukherjes S, Coaxum SD, Maleque M, et al. Effects of oxidized low density lipoprotein on nitric oxide synthetase and protein kinase C activities in bovine endothelial cells[J].Cell MolBiol,2001（6）：1051-1058

　　[4]骆秉铨，冯小平，龙建平，等，银杏叶提取物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华医学杂志，1997（4）：301-302.

　　[5]Ren DC, Du GH, Zhang JT. Protective effects of ginkgo biloba extract on endothelial cell against damage induced by oxidative stress[J].Journal of Cardiovascular Pharmacology,2002 （6）：804-814

　　[6]彭海，李颖，银杏提取物对主动脉内皮细胞细胞黏附因子及NKκB表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2007（14）:2772-2775.