催产素受体基因与儿童孤独症关系的初步研究

顾汉现

催产素受体基因与儿童孤独症关系的初步研究


[ 10-04-22 13:24:00 ]      


作者：姜志梅, 张丽华, 吕智海, 郭岚敏


【摘要】  目的 探讨佳木斯地区人群催产素受体(oxytocin receptor，OXTR)基因多态性与儿童孤独症的关系。方法 应用聚合酶链反应与限制性片断长度多态性分析方法，对30例孤独症儿童和30例正常儿童进行OXTR单核苷酸多态性片断rs2254298的等位基因和基因型测定。结果 OXTR单核苷酸多态性片断rs2254298的基因型分布频率符合HardyWeinberg定律(P>0.05)，并且孤独症组和正常对照组在上述各位点等位基因频率和基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)。结论 OXTR单核苷酸多态性片断rs2254298与儿童孤独症的发病有关。

【关键词】  孤独症; 发育障碍; 受体，催产素; 儿童

　　【Abstract】 Objective To investigate the relationship between oxytocin receptor(OXTR)gene polymorphism and childhood autism in Han population in Jiamusi.Methods Polymerase chain reactionrestricted fragment length polymorphism(PCRRFLP) was used to determine allele and genotype of SNP(rs2254298) of OXTR in 30 Chinese Han autism children staying in the 3rd Affiliated Hospital of Jiamusi University and 30 normal children in a kindergarten and an elementary school in Jiamusi from May to December,2007.Results The genotype distribution of the SNP(rs2254298) in patient group and control group was consistent with the HardyWeinberg equilibrium(P>0.05).There was significant difference in the distribution of the allelic frequencie and genotype in rs2254298 between the two groups(P<0.05).Conclusions There is an association between the SNP(rs2254298) of OXTR and childhood autism.

　　【Key words】 Autism; Developmental disorders; Receptor，oxytocin; Child

　　儿童孤独症过去称为婴儿孤独症，为广泛性发育障碍的一个类型，约75%伴有不同程度的精神发育迟滞[1]。临床上主要表现为3组严重而持续性的特征性症状，即社会交往障碍，局限、重复、刻板的行为模式和兴趣。目前，孤独症的研究虽涉及许多领域，但病因及发病机制尚不清楚，而遗传因素在其发病中起到重要作用的观点已得到国际公认。基因组扫描确定染色体3p2426为孤独症的候选基因[2]，该区含有40个基因，包括OTR基因，但该研究未能证明特异的多态性与孤独症存在关联。

　　人类催产素受体(oxytocin receptor，OXTR)是一种由389个氨基酸组成的含有7个跨膜结构域的多肽，属于G蛋白藕联受体家族的成员，位于染色体3p25，含有3个内含子和4个外显子[3]。大量动物实验研究表明催产素与母婴关系、配偶关系、应激反应、情感和社会认知等有关，最近许多研究者指出神经肽催产素可能与孤独症的发病有关[4,5]。本研究对OXTR基因与儿童孤独症关系进行探讨，旨在为本病的病因学和早期干预提供依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　1.1.1 孤独症组 200705/12佳木斯大学附属第三医院发育与行为儿科收治孤独症患儿30例，其中男25例，女5例，男女比例为5∶1;年龄3～12岁，平均(5.43±2.11)岁。

　　1.1.1.1 诊断标准 符合美国《精神障碍诊断和统计手册》第4版中孤独症的诊断标准[6]。

　　1.1.1.2 纳入标准 (1)汉族;(2)完全符合美国《精神障碍诊断和统计手册》第4版的诊断标准;(3)儿童孤独症评定量表达到儿童孤独症诊断界值;(4)年龄3～12岁;(5)可获得详细的临床资料;(6)获得患儿父母或监护人的知情同意，并愿意参加本研究者。

　　1.1.1.3 排除标准 (1)诊断不明确者;(2)伴有其他神经系统器质性疾病者;(3)患有下列疾病：心、肝、肾、内分泌、血液系统等严重躯体疾病者;(4)排除单纯精神发育迟滞、脆性X综合征及其他广泛发育障碍者。

　　1.1.2 正常对照组 运用随机数字法随机选取佳木斯市某幼儿园和某小学的健康儿童30例，其中男25例，女5例，男女比例为5∶1;年龄3～12岁，平均(5.83±2.07)岁。

　　1.1.2.1 纳入标准 (1)汉族;(2)年龄3～12岁;(3)可获得详细临床资料。

　　1.1.2.2 排除标准 同孤独症组排除标准。

　　1.2 基因组DNA的提取 采集所有研究对象静脉血2 mL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

　　1.3 基因型检测

　　1.3.1 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)与限制性片断长度多态分析方法 用PCR与限制性片断长度多态分析方法检测所有研究对象的基因型。引物参照文献[7]设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。rs2254298上游引5'TGA AAG CAG AGG TTG TGT GGA CAG G3'。下游引物5'AAC GCC CAC CCC AGT TTC TTC3'。

　　1.3.2 25 μL PCR反应体系 ddH2O 13.85 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 5 μL，引物正向和反向的各0.5 μL，Taq酶0.15 μL，MgCl2 1.5 μL,DNA 1 μL。

　　1.3.3 PCR反应条件 95 ℃变性5 min→95 ℃ 30 s→58.3 ℃ 40 s→72 ℃ 40 s(第2～4步32个循环)→72 ℃ 7 min。进行限制性内切酶酶切，并分析基因型。于酶及酶切缓冲液体系中，37 ℃酶切过夜，用6%聚丙烯凝胶电泳读取基因型。

　　1.4 统计学方法 分别计算基因型和等位基因频率，进行HardyWeinberg遗传平衡吻合度检验。采用SPSS 12.0统计分析软件包进行统计学处理，基因型和等位基因频率比较采用χ2检验，多个样本均数比较采用方差分析，多个样本均数间的多重比较采用LSDt检验。

　　1.5 知情同意 所有研究对象的父母或监护人均签署知情同意书。

　　2 结果

　　2.1 研究对象HardyWeinberg遗传平衡吻合度检验结果 见表1。表1 孤独症组与正常对照组rs2254298 HardyWeinberg遗传平衡的χ2检验注：*自由度v=1，P>0.05。

　　所有研究对象均符合HardyWeinberg遗传平衡法则。

　　2.2 rs2254298的基因型和等位基因频率结果 见表2。表2 rs2254298基因型及等位基因频率

　　2.3 BsrⅠ酶切电泳图 见图1。

　　注：1,10，11，12：G/G型(164/101 bp);2，4：A/A型(164/135 bp);3，5，

　　6，7：A/G型(164/135/101 bp);8：50 bp Marker;9：100 bp Marker。

　　图1 BsrⅠ酶切电泳图

　　3 讨论

　　儿童孤独症是一种给患儿家庭和社会带来沉重精神和经济负担的广泛发育障碍性疾病，对其进行病因学研究具有重要的理论和现实意义。据同病率高发家系研究证实遗传因素是孤独症病因中一个不可忽视的因素[8，9]。最近许多研究者指出神经肽催产素可能与孤独症的发病有关[5,10]。YlisaukkoOja等[2]对孤独症样本基因组扫描数据的综合分析后确定3p2426是孤独症的候选基因座位。这一区域包含40个基因，催产素受体基因是其中之一。

　　本研究从OXTR基因多态性与孤独症发病的关系出发，选取多态性片断rs2254298进行扩增并分析基因型，以了解它们之间的关系，为孤独症的早期防治打下基础。经PCR扩增和限制性酶切后发现rs2254298有两种等位基因，即A和G，它们的基因型则为A/A、A/G和G/G。经年龄和性别匹配的孤独症组与正常对照组研究发现，孤独症组和正常对照组的等位基因频率和基因型分布在上述位点差异有统计学意义，提示OXTR单核苷酸多态性片断rs2254298可能与儿童孤独症的发病有关。Wu等[7]在195个汉族核心家系中选择4个单核苷酸多态性片断进行与孤独症的关联研究，发现OXTR单核苷酸多态性与孤独症有关。Jacob等[10]对高加索孤独症儿童和青少年与OXTR的关系进行研究，发现rs2254298与孤独症有关。Lerer等[11]也做了类似的研究，他们对已经标记出的18个单核苷酸多态性进行了研究，发现5个座位，即rs237897rs13316193rs237889rs2254298rs2268494与孤独症显著相关。本研究结果与上述研究结果基本一致，均支持OXTR基因多态性与孤独症有关。

　　本研究从分子遗传学角度探讨儿童孤独症的病因，不仅有助于深入阐明孤独症的分子遗传学基础，而且可为进一步明确孤独症发病的遗传学机制提供客观依据，对实施孤独症基因诊断，研制新型药物以及探索基因治疗的策略具有重要意义。但是本研究存在如下不足之处：一是研究样本量较小，二是样本量仅来自于接受正规诊断及治疗的患儿，并不能反映所有孤独症患儿的情况。因此，今后需扩大研究样本及研究范围，从而为孤独症的基因诊断及治疗提供依据，为孤独症临床治疗开辟新的途径。

【参考文献】
  　　[1] 陶国泰.儿童少年精神医学[M].南京：江苏科学技术出版社，1999：207216.

　　[2] Ylisaukkooja T,Alarcon M,Cantor RM，et al.Search for autism loci by combined analysis of Autism Genetic Resource Exchange and Finnish families[J].Ann Neurol，2006，59(1)：145155.

　　[3] Gimpl G,Fahrenholz F.The oxytocin receptor system:structure,function,and regulation[J].Physiol Rev,2001,81(2):629683.

　　[4] Hollander E,Novotny S,Hanratty M,et al.Oxytocin infusion reduces repetitive behaviors in adults with autistic and Asperger's disorders[J].Neuropsychopharmacology，2003，28(1)：193198.

　　[5] Lim MM,Bielsky IF,Young LJ.Neuropeptides and the social brain:potential rodent models of autism[J].Int J Dev Neurosci，2005，23(23):235243.

　　[6] APA.DSMⅣ[M].Washington DC:APA Press,1994:6578.

　　[7] Wu S,Jia M,Ruan Y，et al.Positive association of the oxytocin receptor gene(OXTR) with autism in the Chinese Han population[J].Biol Psychiatry,2005,58(1):7480.

　　[8] Ijichi S, Ijichi N.The prenatal autistic imprinting hypothesis:developmental maladaptation to the environmental changes between womb and the social world[J].Med Hypotheses,2004,62(2):188194.

　　[9] Rutter M.Genetic studies of autism:from the 1970s into the millennium[J].J Abnorm Child Psychol,2000,28(1):314.

　　[10] Jacob S,Brune CW,Carter CS，et al.Association of the oxytocin receptor gene(OXTR) in Caucasian children and adolescents with autism[J].Neurosci Lett，2007,417(1):69.

　　[11] Lerer E,Levi S,Salomon S，et al.Association between the oxytocin receptor(OXTR) gene and autism:relationship to Vineland Adaptive Behavior Scales and cognition[J].Molecular Psychiatry,2008,13(10):1.