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标题: 脑益康对阿尔茨海默病大鼠中枢胆碱能系统酶的影响 [打印本页]

作者: 顾汉现 时间: 2009-9-13 15:28
标题: 脑益康对阿尔茨海默病大鼠中枢胆碱能系统酶的影响
脑益康对阿尔茨海默病大鼠中枢胆碱能系统酶的影响

[ 09-09-07 11:45:00 ]  作者：耿劲松，周爱玲

【摘要】  　　目的观察中药复方脑益康对阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）大鼠中枢胆碱能系统的保护作用。方法采用脑立体定位仪自双侧基底前脑Meynert核（nucleus basalis of Meynert, NBM）注射鹅膏蕈氨酸（Ibotenic acid, IBO）建立AD大鼠模型，分别给予不同剂量脑益康对AD大鼠进行治疗，测定不同组实验大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）、丁酰胆碱酯酶（butyrocholinesterase, BuChE）活性及胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）在基底前脑的表达。结果脑益康能抑制脑组织AChE和BuChE的活性；改善基底前脑ChAT阳性神经细胞形态并增加其数量。结论脑益康通过促进ChAT表达，增加乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）的合成；通过降低脑组织AChE和BuChE的活性，抑制ACh分解；从而增加脑内ACh含量，改善AD大鼠的学习、记忆障碍。

【关键词】  脑益康；阿尔茨海默病；乙酰胆碱酯酶；丁酰胆碱酯酶；胆碱乙酰转移酶

　　Abstract：ObjectiveTo observe the protective effects of Nao Yikang (NYK) on central cholinergic system in rats with Alzheimer's disease (AD). MethodsBilateral infusions of Ibotenic acid (IBO) into nucleus basalis of Meynert (NBM) using stereotaxic apparatus was adopted to establish the rat model of AD. NYK at different dosage has been administered to AD rats. The activities of brain acetylcholinesterase (AChE) and butyrocholinesterase (BuChE) as well as the morphology of choline acetyltransferase (ChAT)-positive cells in the basal forebrain were detected.ResultsNYK could inhibit the activities of AChE and BuChE, improve the morphology and increase the number of ChAT-positive cells as well.ConclusionNYK may be able to increase the synthesis of acetylcholine (ACh) through elevating the expression of ChAT, inhibit the degradation of ACh by inhibiting the activities of AChE and BuChE, thus elevating the level of ACh in rats' brain and improve the ability of learning and memory.

　　Key words：Nao Yikang; Alzheimer's disease; Acetylcholinesterase; Butyrocholinesterase; Choline acetyltransferase

阿尔茨海默病（AD）是发生在老年前期或老年期，与年龄相关的神经系统退行性疾病。AD的发病机制极其复杂，病因学尚不清楚，且无特效治疗或逆转疾病进展的药物，其病理生理机制及防治研究是近年来神经科学领域的研究热点之一。

祖国传统中医药理论对AD有独到的认识，认为AD属中医学“呆证”“善忘”等病的范畴。中药复方脑益康由制首乌、知母、石菖蒲等组成。制首乌是祖国医学中一种古老的用于延年益寿、益脑调心的药物；中药知母能显著上调脑M1-毒蕈碱型乙酰胆碱受体密度，且上调的幅度和改善记忆之间存在明显的正相关［1］；石菖蒲有改善记忆、扩张血管、降压等作用。脑益康有效成分多，药理作用广泛，可以多层次、多靶点地发挥治疗作用。本实验采用自大鼠双侧基底前脑Meynet核（NBM）注射鹅膏蕈氨酸（IBO）建立AD动物模型，生物化学方法检测皮层乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）活性，免疫组织化学方法观察基底前脑胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性神经细胞形态，为临床应用脑益康治疗AD，促进中枢胆碱能神经功能的恢复提供充分的理论依据。

　　1  器材与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物SPF级SD雄性大鼠60只，体质量(230±10) g，由南通大学实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK（苏）2002-0022。

　　1.1.2 药品与试剂

　　实验所用中药复方脑益康(Nao Yikang，NYK)由南通市中医院制剂室制成颗粒剂，每克颗粒剂含生药1.98 g；脑复康（吡拉西坦片，南京白敬宇制药厂）；IBO（Sigma-Aldrich）；山羊抗ChAT一抗（美国Chemicon，批号：0510012059）；AChE及BuChE测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；二抗免疫组化染色及DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

　　1.1.3 仪器

　　大鼠脑立体定位仪、注射泵及微量注射器（美国Stoelting公司）；Y-型迷宫刺激器（张家港市三兴教学机械厂）；XHF-1高速分散器（上海金达生化仪器厂）；754型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；冰冻切片机（LAICA CM1900，德国）；数码相机（Canon PowerShot S60，日本）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组经Y-型迷宫刺激器筛选的正常大鼠60只，采用随机数字法分为6组。即假手术组（Sham），模型组（Model），脑复康对照组（NFK)，脑益康低、中、高剂量组（NYK-L，NYK-M，NYK-H）。

　　1.2.2 模型的建立大鼠经10%水合氯醛（4 ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪。备头部皮肤，常规消毒手术区皮肤。无菌下操作，沿颅顶中线做2.0 cm纵行切口，止血，钝性分离骨膜。参照大鼠脑立体定位定位图谱［2］：AP-1.14、ML±3.1、DV7.7，于双侧颅骨对应点分别垂直钻一直径1 mm的孔洞。每侧注射IBO 1 μl（5 μg·μl-1），注射时间持续5 min，留针5 min。缓慢拔针后消毒创面，骨蜡封颅骨孔，缝合头皮。假手术组取相同坐标，进针后双侧注射等量灭菌NS。待大鼠清醒后放回笼中常规饲养。

　　1.2.3  给药方案药物均溶于0.5%羧甲基纤维素钠。假手术组给予生理盐水（normal saline, NS）；模型组给予溶剂；阳性药对照组给予0.40 g·kg-1·d-1脑复康；脑益康低，中，高剂量组的药物浓度比依次为1∶2∶4（1.73，3.45，6.90 g·kg-1·d-1），其中，中剂量相当于临床用量。于术后第2天开始灌胃给药，给药容量均为0.1 ml·kg-1。1次/d，连续给药28 d。

　　1.2.4  脑组织AChE，BuChE活性测定断头取脑，称取皮层100 mg，置10 ml带盖塑料离心管中；迅速向管中加入预冷NS 1.0 ml；用XHF-1高速分散器1 500 r/min充分匀浆；4℃离心3 500 r/min，10 min后取上清液。考马斯亮蓝法测定脑组织中总蛋白含量，羟胺比色法测定AChE及BuChE的活性。

　　1.2.5  基底前脑ChAT免疫组织化学染色大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，常规灌注取脑。取实验所需部位脑组织于恒冷切片机中在-20℃下连续冰冻切片，片厚30 μm，选取AP-0.36～AP-2.64断面脑片备用。将脑片放于3%H2O2去离子水中孵育5～10 min；0.01 mol/L PBST漂洗3次；正常兔血清工作液封闭，室温下孵育10～15 min，弃兔血清；滴加1:100稀释的ChAT一抗，4℃过夜，漂洗；二抗工作液37℃孵育10～15 min，漂洗；辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育10～15 min，漂洗。DAB显色、脱水、透明、封固，光镜下观察结果。ChAT阳性标准：细胞浆染成棕黄色。

　　1.3  统计学处理采用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析，数据均以±s表示。显著性检验采用单因素方差分析，两两比较用Scheffé法，以P＜0.05为有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  对AD大鼠脑组织AChE，BuChE活性的影响模型组大鼠脑组织AChE活性较假手术组显著升高（P＜0.01）；脑益康中、高剂量组大鼠脑组织AChE活性较模型组显著降低（P＜0.01），与假手术组相比无明显差异（P＞0.05）。结果见表1。表1  脑益康对AD大鼠脑组织AChE活性的影响（略）

　　与假手术组比较，模型组BuChE活性显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，脑益康中剂量组BuChE活性明显降低（P＜0.05）。结果见表2。表2  脑益康对AD大鼠脑组织BuChE活性的影响（略）

　　2.2  对AD大鼠基底前脑ChAT表达的影响取3组大鼠脑组织，每例连续取AP -0.36～AP -2.64的6张切片，在200×倍光镜下记数基底前脑ChAT阳性细胞数，取其平均值为每例的阳性细胞数。

　　假手术组可见深染的ChAT阳性神经元，数目较多，突触较完整；模型组神经元着色变浅、阳性细胞数目减少（P＜0.01）、胞体缩小、突触不完整甚至消失，提示模型组ChAT表达减少；脑益康中、高剂量组比模型组的阳性细胞数目显著增加（P＜0.01），突触完整性增加，ChAT表达水平增加。见图1及表3。表3  脑益康对AD大鼠基底前脑ChAT表达的影响（略）(中国论文下载中心)

作者: 顾汉现 时间: 2009-9-13 15:29
标题: 脑益康对阿尔茨海默病大鼠中枢胆碱能系统酶的影响(2)
脑益康对阿尔茨海默病大鼠中枢胆碱能系统酶的影响(2)

　　3 讨论

正常情况下，CBF神经元（主要位于基底核、斜角带核和内侧隔核）合成大量乙酰胆碱（ACh）并经胆碱能投射纤维输送至大脑皮层和海马。ACh参与调节大脑的神经元活动，在突触可塑性方面起关键作用。研究表明，当大鼠接受空间及反应性训练时，纹状体和海马ACh释放增加［3］。ACh是记忆形成的必需神经递质和长期记忆的生理基础，ACh通过脑干网状结构上行激动系统维持大脑觉醒状态，而大脑皮层及海马的ACh缺失引起空间认知和记忆障碍。ACh生成及生物学作用的任何环节异常，均可引起胆碱能系统功能障碍。增加ACh合成或减少ACh的分解，可改善学习、记忆能力。

　　ACh在突触间隙被胆碱酯酶（cholinesterase, ChE）水解为胆碱和乙酸，释放出的胆碱大部分经胆碱能转运体被胆碱能神经末稍重新摄取。ChE根据其水解基质的专一性和速度不同分真性AChE和假性AChE，前者又称AChE，后者包括BuChE和丙酰胆碱酯酶（propionylcholinesterase, PrChE）。AChE水解中枢神经系统和副交感神经节后纤维和自主神经节前纤维冲动时所释放的ACh，以保证神经兴奋与抑制的协调统一。AChE活性升高与ChAT活性下降密切相关，且AChE水平与细胞外ACh含量有关［4］。AChE通过抑制突触处ACh降解，使ACh浓度增加，提高AD患者的学习、记忆能力。Bartzokis G.等［5］研究发现，AChE通过增加少突胶质细胞的胆碱能刺激，促进髓鞘形成及修复。

　　本实验检测脑内AChE活性显示，模型组大鼠胆碱能神经元受损后，脑组织AChE活性较假手术组显著升高（P＜0.01）；但脑益康中、高剂量组大鼠脑组织AChE活性较模型组显著降低（P＜0.01），提示中、高剂量脑益康具有较好的AChE抑制作用。脑益康通过抑制AChE，减少ACh的分解，从而改善AD大鼠的学习、记忆障碍。

在中枢神经系统内，BuChE主要表达于胶质细胞，部分表达于内皮细胞和神经元，BuChE可能协同AChE调节中枢ACh水平。组织化学研究表明，某些胆碱能神经元含有BuChE而非AChE［6］。尽管AD患者脑组织中的AChE含量远高于BuChE，但是研究显示，在接受胆碱能神经纤维支配的皮层及海马，均有活化的BuChE［7］，在记忆、认知和行为等方面发挥作用。随着AD的病情发展，BuChE活性进行性增加［8］。因此，抑制BuChE也可能有利于改善AD患者症状。临床随访表明，与多奈哌齐加兰他敏相比，AChE-BuChE的双重抑制剂（如利凡斯的明）能更好地改善AD患者认知能力［9］。

本实验检测脑内BuChE活性显示，模型组大鼠脑组织BuChE活性显著升高（P＜0.01），而脑益康中剂量组大鼠BuChE活性较模型组明显降低（P＜0.05）。提示脑益康对胆碱能系统损伤的AD大鼠脑组织中BuChE活性有影响。

结果提示，脑益康通过抑制脑组织AChE和BuChE的活性，使脑内ACh含量增加，从而改善AD大鼠的学习、记忆能力。

在轴突末稍的轴浆内，ChAT催化乙酰辅酶A的乙酰基与胆碱结合生成ACh。乙酰辅酶A来源于糖酵解，它必须从胆碱能神经元的线粒体转运出来。胆碱能神经元表达一种Na+-依赖性、密胆碱-3（hemicholinium-3, HC-3）敏感性的胆碱能转运体，负责将胆碱摄取到神经元［10］。当突触前神经元兴奋传到其轴突末稍时，突触前膜对Ca2+通透性增加，Ca2+的内流使突触囊泡向突触前膜移动并与之融合，以胞吐方式释放ACh。胆碱能神经元受损引起的脑组织ACh含量减少，是学习、记忆能力下降的重要病理学基础。虽然ACh是最早被确定的一种神经递质，但是，因为ACh很不稳定，故本实验采用免疫组织化学染色方法观察AD大鼠脑组织ChAT的表达。关于AD，最早并已经多次被证实［11～13］：随着患者病程的进展，大脑皮层和海马的ChAT表达水平及活性明显下降，降低程度与痴呆的严重度呈正相关。在AD患者中枢神经系统，出现严重的胆碱能系统功能退变，ChAT异常表达导致ACh合成障碍，使神经传导缺乏必要的胆碱能递质，从而影响学习和记忆。

本实验发现模型组大鼠基底前脑ChAT表达水平明显下降，胆碱能神经元受损，主要表现为神经元着色变浅、阳性细胞数目减少（P＜0.01）、胞体缩小、突触不完整甚至消失，进一步证实了IBO损伤NBM与ChAT的关系。而脑益康使基底前脑的ChAT阳性细胞增多、ChAT表达水平增加；尤其是脑益康中、高剂量组的阳性细胞数目比模型组显著增加（P＜0.01），突触完整性增加，ChAT表达水平增加。说明脑益康可以通过保护胆碱能系统，增强胆碱能神经元功能，使胆碱能神经元的ChAT，ACh水平增加，拮抗胆碱能神经元的损伤，改善AD大鼠的学习、记忆能力。

脑益康对AD复杂发病机制中的多个靶点和环节起到明显的干预作用，在AD胆碱能系统损伤动物模型上表现出神经保护作用，通过抑制脑组织AChE和BuChE的活性，抑制突触处ACh降解；上调基底前脑和额叶皮层的ChAT表达，使胆碱能神经元ACh合成增加，改善受损后功能下降的胆碱能神经元。

【参考文献】
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